常規受精失敗行早期補救ICSI中透明帶結合精子的選擇性應用（附2例報道及文獻復習）

徐鴻毅 羅清炳 陳 娟 張 穎 張 鑫 張昌軍

湖北醫藥學院附屬人民醫院生殖醫學中心（十堰 44200）

·短篇報道·

常規受精失敗行早期補救ICSI中透明帶結合精子的選擇性應用（附2例報道及文獻復習）

徐鴻毅 羅清炳 陳 娟 張 穎 張 鑫 張昌軍*

湖北醫藥學院附屬人民醫院生殖醫學中心（十堰 44200）

自卵胞漿內單精子顯微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）應用于輔助生殖技術獲得成功妊娠以來，ICSI技術已經從單純男性精子的因素推廣到治療免疫性因素、體外受精失敗等因素導致的不孕。近年來,體外常規受精失敗患者的卵母細胞由隔夜行補救ICSI逐步改進到短時補救，很多報道[1-3]已經證實通過短時受精判斷受精與否, 再行補救 ICSI，獲得了良好的妊娠結局。在此基礎上我們對常規受精失敗中行早期補救ICSI時選擇卵母細胞透明帶（zona pellucida, ZP）上黏附的精子行ICSI，現報道2例如下。

臨床資料

一、病例1

患者，女，35歲，月經規律，結婚9年未避孕未孕，2012年3月來我院就診， 輸卵管造影檢查雙側輸卵管梗阻，B超檢測示卵泡發育不良，男方精液檢查診斷為輕度弱精子癥。夫婦染色體檢查正常。標準長方案黃體期降調節超促排卵,于前一月經周期黃體中期D23應用曲普瑞林（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）（德國輝凌公司生產，3.75mg/支）0.1mg皮下注射，月經第11天同時開始給予促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）（瑞士雪蘭諾公司生產，75 IU/支）225 IU/ 支×12d，停用FSH當日，A 型子宮內膜，厚度為10.3mm，卵泡直徑大于18 mm（5個），人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）（珠海麗珠公司生產，5 000 IU/支） 注射5 000～1 000 IU，取卵日男方精液檢查：密度為82×106條精子/mL，精子活動率為68%： a級12%，b級26%，c級30%，d級32%；患者手術獲卵10只，卵冠丘分散度適中，常規授精，加精密度調整為每個卵子周圍約10～15萬條精子，加精5h后拆除卵周顆粒細胞觀察8枚MII期卵母細胞第二極體均未排出，1枚為MI期卵子，半小時后觀察成熟卵子仍未變化，即行補救ICSI，ICSI時選取成熟卵母細胞上黏附精子，16 h后觀察原核，形成7個2PN，繼續培養后獲胚胎7枚，根據Ziebe等[4]進行胚胎形態學評分，Ⅰ級胚胎2枚，Ⅱ級胚胎1枚，Ⅲ級胚胎1枚，Ⅳ級胚胎3枚，移植兩枚Ⅰ級胚胎，余3枚行玻璃化冷凍。移植后14 d 驗尿 hCG 為陽性，移植4周后B超顯示見宮內單胎妊娠,監測中胎心正常，目前已分娩 1個正常女嬰。

二、病例2

患者，女，25 歲，結婚4年未避孕未孕，月經規律。2010年在外院檢查輸卵管造影檢查雙側輸卵管粘連，行雙側輸卵管疏通術，仍未孕，于2013年5月來我中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療，輸卵管造影顯示輸卵管通暢，盆腔粘連，B超檢測排卵正常，男方精液檢查診斷為中度弱精子癥，夫婦染色體檢查正常。標準長方案黃體期降調節超促排卵，于前一月經周期黃體中期D23應用GnRH-a，0.1mg皮下注射，月經第5天同時開始給予FSH 125 IU/ 支×9d，停用促性腺激素（Gn）當日，子宮內膜顯示不均，平均厚度為16mm，卵泡直徑大于 18 mm（4個），hCG 注射1 000 IU，取卵當天男方精液檢查密度4 ×106條精子/mL，精子活動率為53%： a級0%，b級23 %，c級30 %，d級47 %；獲卵14只，卵冠丘分散度適中，常規授精，加精密度調整為每個卵子周圍約10～15 萬條精子，加精5.5h后拆除卵周顆粒細胞觀察11枚MⅡ期卵母細胞第二極體均未排出，3枚未成熟，觀察每個未成熟卵母細胞透明帶黏附有5～10條精子，半小時后觀察成熟卵母細胞極體仍未排除，即行補救ICSI，ICSI選取未成熟卵母細胞上黏附精子，14～16h觀察原核情況，9枚為2PN，繼續培養后獲Ⅰ級胚胎2枚，Ⅱ級胚胎1枚，Ⅲ級胚胎3枚，Ⅳ級胚胎枚，移植兩枚Ⅰ級胚胎，余4枚行囊胚培養，形成兩枚囊胚評分均為4BB，囊胚行玻璃化冷凍。胚胎移植后14d 驗尿 hCG 為陽性，移植后4周B超見宮內單孕囊，目前已分娩 1個 正常男嬰。

討 論

ICSI技術主要用于少、弱、畸形精子癥造成的受精力低下、受精障礙以及梗阻性無精子癥患者的輔助生殖治療。輔助生殖技術的進一步發展，為我們提供了較理想的促排卵方案，足以使我們獲得所需要的成熟卵母細胞，但在每個實驗室幾乎都不可避免的仍然發生一定比例的卵母細胞受精障礙現象，目前在常規受精過程中卵子受精失敗發生率約 5%～15%[5]。對于受精障礙的卵母細胞我們采用補救性ICSI，從原來的18～20h縮短到6～8h[1-3,6]，這為防止卵母細胞提前老化贏得了時間，使有限的卵母細胞控制在受精窗內，取得了一定的效果。由于女性患者卵子數量有限，從體內取出后質量也無從改變，因此尋找潛在提高妊娠空間的方法應從選擇精子的角度考慮。

在體外常規受精中精子數量達到一定的標準才能實施常規受精，加精后的精子數量遠遠高于因嚴重少精子癥行ICSI的精子，在受精障礙補救ICSI中我們所使用的精子是由實驗技術人員用當天常規授精后剩余的精子，從數千萬精子中挑選理想的精子是比較困難的事情，并且用肉眼在低倍顯微鏡下人為主觀地挑選，這樣更難鑒別出精子有無缺陷，也失去了卵子與精子之間的自然選擇。早在1997年Garrett等[7]觀察到，在IVF治療過程中, 通過對與ZP結合的精子形態進行檢查,結果顯示和卵細胞ZP結合精子比普通用于受精的精子在形態上更好。Black等[8]也認為精-卵透明帶理想狀態的結合對受精的完成十分重要, 凡是結合到透明帶上的精子大部分都是形態正常的。另有報道不孕患者在直接行ICSI治療時使用了未成熟卵ZP上穿越的精子行ICSI能取得較好的妊娠率[9]。

在受精障礙補行ICSI中，精子從優化到ICSI實施需要6～8h，研究報道精子過長時間孵育也會產生一些代謝產物，其中活性氧水平過高就會對精子產生脂質過氧化和DNA氧化損傷[10,11]，可能影響其獲能、受精[12]，而培養液中活性氧增多也可以使胚胎碎片增多[13]，在傳統受精障礙補行ICSI 使用的是剩余的、已在體外孵育過長時間的精子，部分精子死亡產生的代謝物也可能會對其他精子帶來不利的影響。研究報道卵子顆粒細胞可以產生抗氧化物質[14]，在精卵混合液滴中的精子特別是結合在透明帶上的精子周圍還存在未剝離的顆粒細胞，在顆粒細胞的環境下可能會因抗氧化物質的作用使精子的氧化損傷更小，因此在受精障礙卵母細胞補救性ICSI時，使用透明帶上結合的精子可能是一種理想的選擇，本文2例中分別用成熟卵母細胞和未成熟卵母細胞結合的精子均獲得了妊娠，可說明選擇卵母細胞成熟度不影響透明帶所黏附的精子質量。

由于這種方法在技術上較常規挑選精子耗時，且去除顆粒細胞后并非所有卵母細胞透明帶上均黏附有精子，這需要技術人員的經驗和操作手法，結局是否優于常規選擇的精子還需要增加樣本量證實。但根據文獻和精子的自然選擇結果，這種方法不失為早期補救性ICSI進一步改進提供了一種新的思路。

透明帶; 精子; 精子注射, 細胞質內

1 孫海翔. 早期補ICSI的安全性和應用價值. 生殖醫學雜志 2009; 18(3): 195-197

2 Nagy ZP, Rienzi LF, Ubaldi FM,et al.Effect of reduced oocyte aging on the outcome of rescue intracytoplasmic sperm injection.Ferti Steril2006; 85(4): 901-906

3 劉素英, 曹英, 曹翔, 等. 早期補救ICSI應用價值的初步探討. 生殖與避孕 2010; 30(11): 742-744, 778

4 Ziebe S, Petersen K, Lindenberg S,et al. Embryo morphology or cleavage state:how to select the bes embryos for transfer after in vitro fertilization.Hum Reprod1997; 12(7):1545-1549

5 Mahutte NG, Arici A. Failed fertililization: is it predictable.Curr Opin Gynecol2003; 15(3): 211-218

6 嚴正杰, 蔡令波, 馮婷, 等. 對體外受精失敗后不同授精時間進行補救ICSI的結局比較. 生殖與避孕 2009; 29(5): 329-332

7 Garrett C, Liu DY, Baker HW. Selectivity of the human sperm-zona pellucida binding process to sperm head morphometry.Fertil Steril1997; 67(2): 362-371

8 Black M, Liu De Y, Bourne H,et al. Comparison of outcomes of conventional intracytoplasmic sperm injection and intracytoplasmic sperm injection using sperm bound to the zona pellucida of immature oocytes.Fertil Steril2010; 93(2): 672-674

9 劉鋒, 丘映, 鄒彥, 等. 精子與卵母細胞透明帶結合對ICSI治療結局的影響. 生殖與避孕 2011; 31(1): 25-29

10 O WS, Chen H, Chow PH. Male genital tract antioxidant enzymes-their ability to preserve sperm DNA integrityMol Cell Endocrinol2006; 250(1-2): 80-83

11 Henkel RR, Schill WB. Sperm preparation for ART.Reprod Biol Endocrinol2003; 1(1): 108

12 Tsunoda S, Kawano N, Miyado K,et al. Impaired fertilizing ability of superoxide dismutase 1-deficient mouse sperm during in vitro fertilization.Biol Reprod2012; 87(5): 121

13 Lee TH, Lee MS, Liu CH,et al.The association between microenvironmental reactive oxygen species and embryo development in assisted reproduction technology cycles. Reprod Sci2012; 19(7): 725-732

14 Matos L, Stevenson D, Gomes F,et al. Superoxide Dismutase expression in human cumulus oophorus cells.Mol Hum Reprod2009; 15(7): 411-419

（2014-09-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.016

R 321-33

*通訊作者, E-mail: sycjzhang@sohu.com