淫羊藿苷對(duì)酒精致雄性小鼠生殖損傷的影響*

劉忠平李質(zhì)馨**田洪艷潘曉燕孫艷美

1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）; 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院病原實(shí)驗(yàn)室

·論 著·

淫羊藿苷對(duì)酒精致雄性小鼠生殖損傷的影響*

劉忠平1李質(zhì)馨1**田洪艷1潘曉燕1孫艷美2

1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）; 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院病原實(shí)驗(yàn)室

目的探討淫羊藿苷對(duì)酒精致雄性小鼠生殖損傷的保護(hù)作用，為臨床治療酒精致男性不育提供理論依據(jù)。方法成年雄性小鼠隨機(jī)分為正常組（蒸餾水）、模型組（酒精組）和給藥組（酒精+淫羊藿苷組），灌胃5周后處死并制備附睪精子懸液，分別測(cè)定精子密度、精子活動(dòng)率、存活率、精子畸形率；JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位改變；制備睪丸組織切片，觀察睪丸組織病理改變。結(jié)果模型組小鼠精子密度、精子活動(dòng)率和存活率明顯低于正常組，精子畸形率明顯增加；給藥組精子密度、精子活動(dòng)率和存活率較模型組明顯升高，精子畸形率明顯降低。線粒體膜電位分析，模型組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例明顯高于正常組；給藥組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例低于模型組。睪丸組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組生精細(xì)胞層數(shù)減少，結(jié)構(gòu)紊亂稀疏；給藥組生精小管結(jié)構(gòu)明顯改善。結(jié)論 淫羊藿苷對(duì)酒精致雄性小鼠生殖損傷有一定保護(hù)作用。

淫羊藿甙; 飲酒; 精子能動(dòng)性; 細(xì)胞凋亡

酗酒已成為當(dāng)今世界日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，極大地影響了我國(guó)的人口素質(zhì)，過(guò)度飲酒也是導(dǎo)致受孕機(jī)會(huì)下降和出生缺陷發(fā)生的主要原因之一。酒精作為一種睪丸毒物對(duì)男性生育能力的影響不容忽視，酒精對(duì)男性生殖系統(tǒng)的損害也已被大量的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。酗酒可使血清睪酮水平下降，性功能減退并導(dǎo)致后代發(fā)育和行為異常[1]，酒精可以通過(guò)減少睪丸內(nèi)細(xì)胞增殖、加快細(xì)胞凋亡來(lái)抑制生殖能力[2]。淫羊藿屬于小蘗科淫羊藿屬植物，其性味辛、甘、溫，李時(shí)珍在《本草綱目》中稱其有“益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”之功效，是中藥中常見(jiàn)的助陽(yáng)藥，廣泛用于不孕、不育、性功能障礙等疾病的治療。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以提高D-半乳糖所致衰老小鼠血清睪酮水平[3]，減少亞急性衰老雄性大鼠生殖細(xì)胞凋亡，改善睪丸組織的退行性變化，延緩性腺衰老[4]，淫羊藿苷對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠血清睪酮含量下降、性腺雄激素受體mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)下降也有一定的抑制作用[5]，有助于增強(qiáng)性功能。精液質(zhì)量狀況是反映男性生育力的客觀的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。精液分析也是評(píng)價(jià)男性生育力的重要依據(jù)[6]。線粒體膜電位變化為凋亡的特異性改變。本實(shí)驗(yàn)在建立酒精損傷小鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察淫羊藿苷對(duì)小鼠精液質(zhì)量、線粒體膜電位變化及睪丸組織改變的影響，探討淫羊藿苷對(duì)酒精致小鼠生殖功能損傷的保護(hù)作用，旨在為淫羊藿苷治療男性不育提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性昆明種小鼠30只，體質(zhì)量（25±2）g（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為正常組（蒸餾水）、模型組（酒精組）和給藥組（酒精+淫羊藿苷組），每組10只。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃，濕度50%～60%，自然光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

二、主要儀器與試劑

三用恒溫水箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；淫羊藿苷（規(guī)格：98%，HPLC），黃色粉末，陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司，用雙蒸水配成36mg/mL的混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫话拙疲?6%），北京紅星股份有限公司；多聚甲醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nucleo Counter NC-3000TM線粒體膜電位檢測(cè)儀，丹麥。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）建立動(dòng)物模型

模型組每天上午10點(diǎn)按10ml/kg灌胃28%的酒精（白酒與蒸餾水以1:1比例稀釋）；給藥組每天上午10點(diǎn)按10ml/kg灌胃28%的酒精，下午2點(diǎn)按90mg/k灌胃淫羊藿苷；正常組給予等量蒸餾水灌胃；連續(xù)灌胃5周。

（二）精子密度的測(cè)定

頸椎脫臼處死小鼠，打開(kāi)腹腔，快速剝離雙側(cè)附睪，置于盛有2mL生理鹽水（37℃預(yù)溫）的平皿中，用眼科剪刀剪數(shù)剪，再將平皿37℃孵育10min，待精子自由游出，即制成精子懸液。精子密度采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定法計(jì)數(shù)。

（三）精子活動(dòng)率與精子存活率的計(jì)算

取上述精子懸液10μL置于玻片上，蓋上蓋玻片后鏡下觀察計(jì)數(shù)至少200個(gè)精子，計(jì)算精子活動(dòng)率。用1%剛果紅染色法檢測(cè)精子存活率，死精子著紅色，活精子不著色，用活精子數(shù)與總精子數(shù)的比值表示精子存活率。

（四）精子畸形率的計(jì)算

取精子懸液用4層擦鏡紙過(guò)濾，涂片，干燥，甲醇固定，干燥，2%伊紅溶液染色1h，用水輕沖，干燥。在高倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的部位計(jì)數(shù)1000個(gè)完整精子，計(jì)算總精子畸形率。

（五）細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

處死小鼠取下附睪后，每組取5只小鼠的睪丸，剪開(kāi)白膜，用注射器芯剝出生精小管置于100目細(xì)胞篩上，輕輕研磨，過(guò)濾，離心，棄上清，收集細(xì)胞，加PBS，制備細(xì)胞混懸液，采用Nucleo Counter NC 3000TM對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。

（六）睪丸組織切片標(biāo)本制備

每組余下5只小鼠的睪丸放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，常規(guī) 5μm切片, 經(jīng)脫蠟、脫水處理后, 蘇木精-伊紅染色, 脫水，透明，常規(guī)封片，鏡下觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、淫羊藿苷對(duì)酒精損傷小鼠精液質(zhì)量的影響

模型組小鼠精子密度、精子活動(dòng)率、存活率較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），給藥組小鼠精子密度、精子活動(dòng)率、存活率較模型組得到明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。結(jié)果提示淫羊藿苷可以拮抗酒精對(duì)小鼠精子密度、精子活動(dòng)率、存活率的影響。

表1 淫羊藿苷對(duì)酒精損傷小鼠精液質(zhì)量的影響（n=10，±s）

表1 淫羊藿苷對(duì)酒精損傷小鼠精液質(zhì)量的影響（n=10，±s）

注:*與正常組相比較, P＜0.01;△與模型組相比較, P＜0.01

組別 精子密度(×106個(gè)/mL) 活動(dòng)率(%) 存活率(%)正常組 31.52±1.76 82.16±1.35 90.36±1.81模型組 10.87±1.07*63.51±1.62*71.53±1.82*給藥組 21.27±1.69△73.63±1.92△82.39±2.21△

二、淫羊藿苷對(duì)酒精損傷小鼠精子畸形率的影響

模型組小鼠精子畸形率為（5.97±0.32）%，較正常組（2.95±0.30）%明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），給藥組小鼠精子畸形率為（4.19±0.28）%，較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果提示淫羊藿苷可以拮抗酒精對(duì)小鼠精子形態(tài)造成的損傷作用。

三、細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

JC-1染色，Nucleo Counter NC-3000TM檢測(cè)分析，健康細(xì)胞呈紅色熒光，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，利用紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比判斷細(xì)胞的線粒體膜電位是否發(fā)生去極化和凋亡。模型組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例為（75.80±1.50）%（圖1B），明顯高于正常組（32.50±1.22）%（圖1A）；給藥組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例為（56.10 1.33）%，低于模型組（圖1C），差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

四、小鼠睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的改變

光鏡下觀察可見(jiàn)，正常組睪丸生精小管結(jié)構(gòu)完整，生精細(xì)胞排列緊密有序，層次清楚（圖2A）。模型組睪丸生精小管管壁萎縮變薄，生精細(xì)胞層數(shù)減少、排列紊亂稀疏（圖2B）。給藥組睪丸生精小管的形態(tài)較模型組有所改善,各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量明顯增加細(xì)胞排列較整齊（圖2C）。

圖1 Nucleo Counter NC-3000TM對(duì)線粒體膜電位的檢測(cè)

圖2 小鼠睪丸組織病理改變（HE,×400）

討 論

生殖健康是人類社會(huì)文明的核心，但在過(guò)去幾十年里，研究資料顯示人類精液質(zhì)量正逐漸下降[7]，而且降低具有低齡化的趨勢(shì)。人類的生殖功能正在不斷衰退。其中酒精對(duì)生殖能力的影響毋庸置疑。酒精有明顯的生殖毒性，孕期過(guò)量飲酒可引起胎兒酒精綜合征。酒精可以導(dǎo)致精母細(xì)胞退化，精子數(shù)量減少[8]，初級(jí)精母細(xì)胞染色體畸變率增高，精液質(zhì)量下降，睪酮合成受到抑制。酒精可以抑制睪丸內(nèi)維生素A的活性，造成維生素A和鋅的缺乏，從而引起生精上皮細(xì)胞發(fā)育不良，睪丸萎縮，導(dǎo)致少精子癥或無(wú)精子癥[9]。淫羊藿是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的補(bǔ)益中藥, 具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨等功效。淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分，也是研究含有淫羊藿中成藥藥理作用的首選成分。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷有明顯的性激素樣作用，可直接刺激性腺而發(fā)揮其“壯陽(yáng)”作用。淫羊藿苷能作用于睪丸Leydig細(xì)胞而提高睪酮的合成[10]，促進(jìn)幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育，對(duì)離體培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的基礎(chǔ)分泌和cAMP 的生成也有促進(jìn)作用[11]。淫羊藿苷可以直接作用于高級(jí)生殖調(diào)控中樞，起到補(bǔ)腎助陽(yáng)的作用。淫羊藿苷有很強(qiáng)的促進(jìn)生殖的效果，但其對(duì)酒精所致生殖系統(tǒng)損傷的影響及機(jī)制仍有待研究。精子密度、存活率是反映生育能力的主要參數(shù)。精子運(yùn)動(dòng)能力是精子結(jié)構(gòu)與功能的綜合體現(xiàn),精子運(yùn)動(dòng)能力的改變可作為衡量環(huán)境因素對(duì)雄性生殖功能影響的一項(xiàng)重要指標(biāo)[12]。精子形態(tài)與精子功能密切相關(guān)，任何形態(tài)上的缺陷都將導(dǎo)致受精功能下降，影響男性生育力。線粒體是參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡中，線粒體膜電位將發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)從精液質(zhì)量、精子畸形、細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)、睪丸組織病理改變幾方面觀察淫羊藿苷對(duì)酒精致小鼠生殖損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠精子密度、精子活動(dòng)率、存活率均較模型組明顯提高，精子畸形率明顯降低；去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例明顯降低；生精小管結(jié)構(gòu)得到明顯改善，說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)酒精致雄性小鼠生殖損傷有一定的保護(hù)作用，但其具體保護(hù)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 Kumar S, Kumari A, Murarka S. Lifestyle factors in deteriorating male reproductive health.Indian J Exp Biol2009; 47(8): 615-624

2 Koh PO, Kim MO. Ethanol exposure decreases cell proliferation and increases apoptosis in rat testes.J Vet Med Sci2006; 68(10): 1013-1017

3 陳凱, 劉浩然, 蘇燕慧, 等. 淫羊藿苷對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠睪丸病變的影響. 中國(guó)老年學(xué)雜志 2011 31(10): 1816-1818

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6 王奇玲, 唐立新, 唐運(yùn)革, 等. 生育力男性精液檢測(cè)與計(jì)算機(jī)輔助分析參數(shù)的主成分分析. 中國(guó)男科學(xué)雜志2010; 24(11): 30-36

7 Olsen J, Zhu JL, Ramlau-Hansen CH.Has fertility declined in recent decades?.Acta Obstet Gynecol Scand2011; 90(2): 129-135

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（2014-06-26收稿）

Effects of icariin on reproductive damage in alcohol-treated male mice*

Liu Zhongping1, Li Zhixin1**, Tian Hongyan1, Pan Xiaoyan1, Sun Yanmei2
1.Deparment of Histology and Embryology,Jilin Medical College, Jilin 132013, China;
2. Pathogenic Laboratory,Jilin Medical College

Li Zhixin, E-mail: lzx-62@163.com

ObjectiveTo explore the protective effects of icariin on reproductive damage in alcohol-treated male mice，and provide the theoretical basis for clinical treatment of male infertility induced by alcohol.MethodsAdult male mice were randomly divided into the normal group, the model group and the treated group. Mice in the model group were made by gavage with alcohol. Mice in the treatedgroup were treated by gavage with alcohol and icariin simultaneously. Mice in the normal group were given distilled water. After 5weeks, all the mice were killed and the epididymis were made into sperm suspension. Sperm density,sperm motility,sperm viability and sperm malformation rate were detected respectively. Mitochondrial potential was examined with JC-1. The pathological changes of testes specimens were observed under the microscope.ResultsThe sperm density,sperm motility and sperm viability in the model group was lower than that in the normal group, andthe rate of sperm deformation was signif cantly increased. The sperm density,sperm motility and sperm viability in the treated group was higher than that in the model group, and the rate of sperm deformation was decreased. The rate of depolarization cells(apoptosis cells) in the treated group was lower than that in the model group. The layer number of spermatogenic cells decreased in the model group, and the structure of seminiferous tubules were disorganized.The structure of seminiferous tubules was improved signif cantly in the treated group.ConclusionThe icariin has protective effects on reproductive damage in alcohol-treated male mice .

Icariin; alcohol drinking; sperm motility; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.001

R 698.2

資助: 吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2013477；2012484）; 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140204033YY）;吉林市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013625023）
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, E-mail: lzx-62@163.com