鼻咽癌患者鼻咽分泌物EB病毒DNA的臨床應用價值

田秋紅 張濤 趙亮

鼻咽癌患者鼻咽分泌物EB病毒DNA的臨床應用價值

田秋紅 張濤 趙亮

目的 評價鼻咽癌患者鼻咽分泌物 EB 病毒 DNA(EBV-DNA)的臨床應用價值。方法 55例慢性鼻咽炎患者 (A 組 )及 55 例鼻咽癌患者 (B 組 )的鼻咽分泌物標本 , 應用熒光定量 PCR 檢測標本中的 EBV-DNA, 并將兩組的檢測結果進行分析。兩組的檢測陽性率采用χ2檢驗 , EBV-DNA 拷貝數比較采用軼和檢驗。結果 A、B 兩組的鼻咽分泌物 EBV-DNA 的陽性例數為 5 例、38 例 , 陽性率分別為9.1%、69.1%。可見 , B 組的陽性率顯著高于 A 組 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)。A、B 兩組的的平均濃度分別為 0 copies/ml、(2.98±0.25)×102copies/ml, 可見 , B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)。結論 采用熒光定量 PCR 技術能對鼻咽分泌物中的 EBV-DNA 進行檢測 , 從而在鼻咽癌的早期診斷、臨床分期、復發轉移及預后評估中具有重要的臨床應用價值。

熒光定量 PCR ；鼻咽癌 ；EB 病毒 DNA ；鼻咽分泌物

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma, NPC)在耳鼻喉科惡性腫瘤中比較常見 , 且發病隱匿 , 部分患者確診后 , 已經出現了頸部淋巴結轉移。從而使最佳的治療時機延誤 , 治療效果及預后較差 , 大大影響了患者的生存質量及 5 年生存率［1］。因此 , 對鼻咽癌患者早期進行確診及治療 , 能夠有效的提高治療效果及預后。EB 病毒屬于一種皰疹病毒 , 通常長期在口咽部上皮細胞及 B 淋巴細胞中潛伏 , 以游離環狀 DNA 的形式存在于胞漿中。有文獻報道顯示 , 鼻咽癌的發生發展與 EB 病毒關系密切 , 且在研究中對很多鼻咽癌患者的血清進行檢測 , 從而發現存在 EB 病毒抗體 , 與正常人群差異顯著［2］。同時 , 近年來熒光定量 PCR 技術的廣泛應用 , 從而能夠對 EB 病毒 DNA(EBV-DNA)含量進行檢測 , 在鼻咽癌的早期診斷和療效評估中意義重大。本文中 , 本院采用熒光定量 PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQPCR)技術檢測經病理確診的 55 例鼻咽癌患者及 55 例慢性鼻咽炎患者的鼻咽分泌物中 EBV-DNA 含量 , 并將結果進行比較分析 , 現總結如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集本院 2007 年 6 月 ~2012 年 6 月在門診確診的 55 例慢性鼻咽癌患者 (A 組 )及經病理確診的 55 例鼻咽癌患者 (B 組 ), 其中 A 組男 35 例 , 女 20 例 , 年齡 37~79歲 , 平均年齡為 (52.2±10.7)歲。B 組男 33 例 , 女 22 例 , 年齡 36~81 歲 , 平均年齡為 (54.1±12.6)歲。B 組患者全部為非角化上皮細胞癌 , 病理分期：Ⅰ期 4 例 , Ⅱ期 19 例 , Ⅲ期 23 例 ,Ⅳ期9例。慢性鼻咽炎及鼻咽癌患者均采取鼻咽纖維鏡附帶的吸引系統及自制的吸管遠端收集裝置對鼻咽分泌物進行采集 , 采集分泌物后立即送檢。

1. 2 試劑及方法 將鼻咽分泌物采用吸管進行反復輕微吹打 , 將其振蕩搖勻 , 吸取 1.5 ml液體至離心管中進行 5 min離心 操 作 , 轉 速 為 12000 r/min, 將沉淀 物 收 集 后 , 加 入 50 μl DNA 提取液 , 充分振蕩搖勻。置入 100℃恒溫下 10 min, 再進行 5 min 離心操作 , 轉速為 12000 r/min, 提取上清液 2 μl制作擴增模板。雙末端標記熒光探針序列為 5'- (FAM)CTGTC TGTAAAGTCCAGCCTCC- (TAMRA) 3'。引物序列為 5'-TCTCTGCC TCCAGGCAAG-3'和 5'-AGAGGGCCTCCACCGT-3', 將 DNA 模板提取液添加至 PCR 反應管中 , 反應液總容量為 50 μl。建立陰性對照、陽性對照、陽性標準品及質控品。在 93℃進行 2 min, 93 ℃ 進行 30 s 至 55℃進行 60 s, 重復 10 個循 環 , 93℃進行 30 s 至 5℃進行 45 s 重復 30 個循環 , 操作結束后 ,儀器將顯示結果。檢測標準［3］：以 5×102copies/ml為界限 ,超過或等于該數值的為陽性 , 低于該數值的為陰性 , 拷貝數以 0 計。本檢測方法的特異度為 92.2%, 靈敏度為 63.3%。熒光定量核酸擴增儀購于美國 ABI公司 , EB 病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒購于上海科華生物工程股份有限公司。

1. 3 統計學方法 全部數據采用 SPSS13.0 統計學軟件進行分析 , 計量資料采用均數 ± 標準差 ( x-±s)表示 , 計數資料采用 χ2檢驗 , 單向有序計數資料比較采用軼和檢驗 , 以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 兩組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性情況 A 組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性為 5 例 , 陰性為 50 例 , 陽性率為 9.1%, 而對照組鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性為 38 例 ,陰性為 17 例 , 陽性率為 69.1%, 可見 , B 組的陽性率顯著高于A 組 (χ2=41.58, P＜0.01), 差異具有統計學意義。

2. 2 兩組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 濃度情況 A 組的平均濃度為 0 copies/ml, B 組的平均濃度為 (2.98±0.25)× 102copies/ml, 可見 , B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異具有統計學意義 (P＜0.05)。

3 討論

EB 病毒在鼻咽癌的發生及發展過程中意義重大。EB病毒對人體進行感染 , 在裂解期病毒基因中表達完全 , 細胞主要合成早期細胞內抗原及衣殼抗原［4］。因此 , 在鼻咽癌患者內存在多種較高水平的抗 EB 病毒相關抗原的抗體 , 而這些抗體中 , VCA/IgA 和 EA/IgA 抗體的檢測最具有診斷價值。絕大多數鼻咽癌患者的血清 VCA/IgA 抗體陽性 , EA 在 EB 病毒開始復制時產生 , 而鼻咽癌患者中 EA/IgA 抗體特異性較高［5］。因此 , EB 病毒已作為一種鼻咽癌腫瘤標志在鼻咽癌的診斷及預后評估中得到廣泛的應用。且EB病毒已被國際癌癥研究機構列為Ⅰ類致癌物質［5］。

同時隨著 PCR 技術的發展 , 出現了熒光定量 PCR 技術(FQ-PCR)。該技術在常規 PCR 基礎上加入熒光標記探針 ,把核酸擴增、分子雜交及光譜技術相互結合 , 從容能夠監測擴增前標本中核酸模板的數量 , 從而能夠對 PCR 進行定量檢測［2］。FQ-PCR 在治療監測腫瘤或病毒、調控機體基因表達、診斷疾病中作用重大。

通常對鼻咽癌患者檢測 EBV-DNA 的標本有轉移的淋巴結、腫瘤組織、外周血中的血漿及血清等。而取淋巴結或腫瘤組織標本時 , 操作過程復雜 , 對患者造成較大的創傷 , 而血漿或血清標本操作簡便 , 但敏感度較差［1］。因此 , 需要找尋一種更簡便及靈敏度更高的標本取材途徑。因此 , 鼻咽分泌物中的腫瘤標志的檢測開始受到學者的關注。本文研究中, A、B 兩組的鼻咽分泌物 EBV-DNA 的陽性率分別為 9.1%、69.1%。B 組的陽性率顯著高于 A 組 , 差異有統計學意義 (P＜0.01)。A、B 兩組的的平均濃度分別為 0 copies/ml、(2.98±0.25)× 102copies/ml, B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)。且本檢測方法的特異度為 92.2%, 說明鼻咽分泌物中 EBV-DNA 的檢測結果在診斷鼻咽癌的早期診斷中具有一定的臨床價值。

總之 , FQ-PCR 技術操作簡便 , 定量準確 , 能夠定量的檢測鼻咽分泌物 EBV-DNA 陽性率及濃度情況 , 在鼻咽癌患者早期診斷及預后評估中具有重要的臨床意義。

［1］羅碧強 , 張麗衛 , 竇曉青 , 等 .鼻咽癌患者唾液中 EB 病毒特異性抗體水平檢測的價值 .廣東醫學 , 2012, 33(6):828-830.

［2］劉飛 .鼻咽癌患者外周血 EBV-DNA 水平與癌組織細胞凋亡的相關性 .山東醫藥 , 2011, 51(50):97-98.

［3］張速林 , 李薇 , 曾蘭蘭 , 等 .聯合檢測 EB 病毒相關抗體和抗原對診斷鼻咽癌的價值 .華南國防醫學雜志 , 2011, 25(3):262-263.

［4］陳瑜萍 , 阮輝 , 肖志勇 .鼻咽癌患者 EB 病毒檢測的臨床意義 .成都醫學院學報 , 2012, 7(2):266-268.

［5］陳冬平 , 齊斌 , 余意 , 等 .鼻咽癌遠期生存率及預后因素分析 .實用醫學雜志 , 2012, 28(12):1999-2001.

2014-05-20］

475000 開封市中醫院檢驗科 (田秋紅 )；開封市兒童醫院急診科(張濤 趙亮)