實驗計劃法概述及其在藥學中的應用

馬涵濤

（河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471003）

實驗計劃法（DOE）是一種以方差分析為基礎，利用概率論、數理統計和線性代數等基本統計理論及最少實驗次數安排（直交表），科學地安排實驗方案，正確地分析實驗結果，盡快獲得優化方案的一種數學方法。DOE包括一系列的統計技術，可用于統計和非統計數據，對復雜的關系進行統計和分析，以找出變異產生的根源，確定每個變量的作用和變量之間的相互影響。自Fisher 1958年發明該方法以來，在農學、工程技術等學科領域得到了廣泛應用，20世紀70年代Sucker[1]和Leuenberger[2]率先將DOE應用于醫藥領域。傳統的實驗操作均以標準操作規程（SOP）為基準進行，DOE使用實驗的方法來驗證標準操作中參數產生的合理性，通過對實驗參數進行篩選和優化，構建科學、高效的實驗方法和技術路線，提高實驗效率及精確度。

1 工藝設計進展

隨著全球經濟一體化格局的形成及信息技術的普遍應用，在世界范圍內有效配置資源已成為可能，企業面臨著日趨嚴峻的市場競爭。競爭的焦點從早期的降低勞動力成本，20世紀70年代的提高企業整體效率，以及20世紀80年代的全面滿足以質量、價格、交貨期與服務等方面要求為核心的競爭，轉化為現在的新產品競爭。這是由于顧客越來越復雜多變的個性化需求，以及現代工業設計技術的快速發展導致的。工業設計是一種運用工程技術方法，在社會、經濟和時間等因素約束范圍內，根據市場需求從事的產品設計工作。根據國際公認的理解，工業設計是一種創造性行為，因此具有藝術性；而同時由于應用了大量的以數理統計為基礎的設計控制技術，故又具有科學性。

20世紀80年代，由摩托羅拉公司首先提出了六西格瑪管理法。1999年3月，由Steve Zinkgraf博士將六西格瑪管理法運用于設計開發領域，并結合設計控制技術創立了六西格瑪設計（DFSS）方法體系。該方法用關鍵質量特性（CTQ）準確定義與跟蹤顧客需求，并將設計控制劃分為定義（define）、測量（measure）、分析（analyze）、設計（design）與驗證（verify）5 個階段，簡稱為 DMADV。定義:選定設計項目，并進行前期市場預研。測量:將顧客需求轉化成關鍵質量特性，對關鍵質量特性盡量用可測量的定量數據表達，并對系統設計進行評價和控制。分析:即分析影響關鍵質量特性和詳細設計輸出的影響因素，進行主次排序，采用適宜的分析工具來對詳細設計階段進行分析和評價，并進一步建立初步實驗計劃。設計:實施詳細設計進行具體的實驗設計以優化參數組合，并對詳細設計結果進行評價。驗證:進入改進設計階段，完成工藝設計，進行樣機實驗及小批量實驗，對詳細設計結果進行驗證，并最終形成量產，完成整個設計項目。

日本質量管理專家田口玄一（Taguchi）博士認為，工業產品70%的質量水平是在設計階段決定的，因此可以說產品的質量是設計出來的而不是制造出來的。從統計質量管理的角度看，設計質量的改進過程就是不斷聚焦與顧客需求同步的產品質量特征值，并在設計周期中盡量減少與這些質量特征值之間差異的過程。設計質量控制技術是達成設計質量改進的一組工具方法集，主要包括質量功能展開（QFD）、失效模式與影響分析（FMEA）、故障樹分析（FTA）、田口穩健設計方法（Taguchi）、響應曲面模型（RSM）及調優設計（EVOP）等。

從設計質量控制技術特點來看，田口穩健設計、響應曲面模型與調優設計都屬于實驗設計法范疇。從實驗設計的發展來看，實驗設計法主要分為兩大流派:一是西方統計質量專家（以G.E.BOX為代表）提出的經典方法，二是日本著名質量管理專家田口玄一博士創立的田口方法。經典方法采用統計回歸的思想擬合出質量特性和影響因素之間的函數關系，并進行響應曲面分析，尋找工藝參數的最佳配置，從而使輸出質量特性最優。經典方法追求均值最優，統計推導嚴謹，實驗階段分明，有序貫性的特點。田口方法注重實驗設計與工程技術的結合，提出穩健設計的思想，在實驗中綜合考慮誤差因素，尋求設計參數的優化配置，從而獲得較為穩定的輸出質量特性。

2 經典實驗設計法的介紹和評估

2.1 簡介

實驗設計過程可分成實驗方案的設計和實驗結果數據分析兩部分。實驗方案的設計包括確定實驗指標、選取因素、確定因素水平、建立實驗指標的數學模型和設計實驗方案。實驗設計的方法類型很多，但為了提高實驗的準確性和可靠性，都必須遵循3個基本原則，即隨機化原則、重復原則和局部控制原則。實驗結果數據分析是應用線性代數、概率論和數理統計等數學工具對實驗數據進行分析和處理，包括擬合模型、對模型的檢驗、實驗統計量的計算及對實驗經過的解釋等。通常所說的實驗設計是指以概率論、數理統計和線性代數等為理論基礎，科學地安排實驗方案，正確地分析實驗結果，盡快獲得優化方案的一種數學方法。

在企業研發和管理實踐中，為了開發、設計、研制新產品，更新或改進老產品，優化生產工藝方法或流程，降低原材料、動力等資源消耗，都需要深入研究質量特性與影響因素的關系。一個標準設計/生產過程都要受到可控因素X1，X2…Xn以及不可控因素Z1，Z2…Zm的共同作用。一般情況下，質量特性和影響因素之間的關系式并不能根據工程知識直接建立，需要使用DOE進行實驗與分析來找出其關系，進一步確定設計/工藝參數的優化組合。在設計過程中，DOE是至關重要的改善技術。

2.2 評估

2.2.1 因子設計（factorial DOE）

主要用于篩選設計，適用數學模型為線性模型。

完全要因設計（full factorial DOE，也稱為析因實驗）:是應用最普遍、最簡單的一種類型。假設某一實驗包括3個因素，每個因素設高、低2個水平，可將其視為一正方形，各因素水平相交于正方形的角上，該正方形即為考察區域。其他各種類型設計均是在基于此正方形的邊或面的中心增加實驗點。對于 n個因子 k水平的完全要因實驗，模型中的主效應與交互效應共計 kn－1個，模型中需要估計的參數有 kn個，因此完全要因實驗需要 kn次實驗。一般選擇兩水平因子實驗對主效應與交互效應進行分析和評價，然后用追加中心點的方法判斷響應擬合過程中是否存在曲率。根據效應稀疏原理，很多系統在主效應和低階的交互作用處于支配地位時，高階交互作用一般可被忽略，因此二階以上的交互作用可以不用考慮。若存在曲率，則采用響應曲面模型進行分析。

部分要因設計:部分要因設計源自完全要因設計[3－4]。由于設計中常常面對3個以上因子的參數優化選擇問題，完全要因設計中盡管設定因子為兩水平，但隨著因子數的增加，實驗次數還是會以指數級增長，因此在因子數較多時，可選擇部分要因設計。將 n個2水平因子安排在2n－p次實驗中，實驗次數受 p值的調節，p＝1時是1/2部分要因實驗，p＝2時則是1/4部分要因實驗……依此類推。實驗次數的降低使主因子與交互作用及交互作用間存在了混淆關系，博克斯－亨特（BOX－Hunter）進行了分辨度設計（Design Resolution）。如分辨度Ⅲ是指主因子間沒有混淆，但主因子與兩因子交互作用以及兩因子交互作用間存在混淆關系；分辨度Ⅳ是指主因子間及主因子與兩因子交互作用沒有混淆，但兩因子交互作用間存在混淆關系；分辨度Ⅴ是指主因子間、主因子與兩因子交互作用及兩因子交互作用間均未混淆，但兩因子交互作用與三因子交互作用之間存在混淆關系。分辨度越低，實驗次數越少，混淆關系越復雜。

普通因子設計（general factorial design）:普通因子設計各因子水平數可以不同，其實驗次數為各因子水平數之積。如某試驗涉及2個因子A和B，因子A包括3個水平，因子B包括4個水平，則實驗次數為12次。通常用于所涉及因子水平數不一致的情況。

Plackett－Burman設計:1946年，Plackett和 Burman提出了Plackett－Burman設計。此設計是一種非常經濟的設計方法，實驗次數均為4的倍數，因其分辨度較低，兩因子間交互作用嚴重混淆，主要用于只有主因子發揮作用的篩選設計，所有的交互作用均被忽略。各因子均為兩水平，設計過程中因子數為11，19，23，27，31共5種，實驗次數為 n＋1次（n為因子數）。如果實驗中所包含因子達不到上述5種規定數量，則設定一定數量啞因子（dummy factor）達到上述數量即可。

2.2.2 響應曲面模型（RSM DOE）

在科學研究和技術實踐中線性關系僅為特例，多元關系的非線性是客觀規律的主流。RSM是對多元關系的非線性進行優化的實驗方法之一，于1951年由Box等[5]提出，可同時評估幾個因子的效果及其交互作用，而傳統的優化方法一次僅能對一種因子進行優化，且難以比較幾個因子間的交互作用。響應曲面模型分2個階段:上述的因子實驗是第一階段，用于建立一階數學模型，從而可以分析出重要影響因子與輸出的變化規律，確定最優的因子組合；第二階段，選擇響應曲面模型方法擬合二次回歸方程，并繪制出響應曲面與等高線圖。

RSM只適合連續的計量值的擬合，用于考察一系列定量參數和1個或多個響應值之間的關系，主要包括中心復合型設計（CCD）和Box－Behnken設計。CCD其實是兩水平因子設計（完全要因設計或部分要因設計）增加中心點和軸向點，其因子的水平數可達五水平，即＋α，－α，＋1，－1，0，面向中心點設計 α值為1，因此只有3個水平。其α值與因子數有關。因子可為數值因子（numeric factors）和絕對值因子（categoric factors），每增加 1 個絕對值因子或其水平增加1個實驗次數將增加1倍。CCD通常需增加3～5個中心點，用以估計實驗誤差和考察模型的準確程度。增加的軸向點可以更好地評價各水平所取范圍內的效果，使結果更具可靠性[6]。Box－Behnken設計每個因子有三水平，沒有軸向點，所有實驗點均在考察范圍之內。與相同數量因素的CCD相比，實驗次數相對較少，因此更快捷，更經濟。

3 DOE的步驟及數據分析

DOE通常分6步進行:確定影響實驗結果的各種因素、水平和對實驗結果進行評估的響應值；選擇適宜的實驗設計方法，篩選設計或優化設計；產生設計矩陣，進行實驗；將實驗結果輸入計算機，產生效果圖，顯示實驗結果整體趨勢；進行下一步實驗設計，得出最佳化值；對結果進行驗證。

DOE涉及大量數據的產生與使用，手動分析DOE數據工作量，難度都非常大，必須有良好的信息管理系統，借助計算機信息技術對這些大量的數據進行管理和分析，才能獲得最佳的效果。DOE軟件目前只有英文的，一般都具有 t檢驗、回歸分析、反應曲面法（RSM）、變異數分析（ANOVA）、反應圖表（response graphs）等功能，Design Expert是當前使用最廣的DOE軟件，在響應曲面和混合設計方面比JMP和MINITAB詳細完整得多，它擁有混合式設計（mixture Design），可在最短的時間發現最佳化的公式，用最少的成本和時間，找出影響實驗的重要因子。如實驗因子有 X，Y，Z 3項，透過實驗設計可找出系統的反應。假設系統的反應是f（x，y，z）＝100 X＋10 Y＋ Z，就可以忽略 Z 因子，甚至是 Y 因子，因為整個系統幾乎是由 X因子所操控。系統的反應可以簡化成 f（x，y，z）＝100 X。因實驗時實際實驗的組合有限，而優化分析的結論來自于統計推理，難免與實際情況有偏差，故需要進行確認實驗，即按所得最佳設定運行過程，檢驗實際結果是否與預期一致。

4 DOE在制藥行業中的應用

DOE在制藥行業中的應用主要包括提取純化、成型工藝等因素的篩選與水平優化、方法驗證時的穩健性試驗。設計方法的選擇既要考慮信息需求，又要考慮實驗數量。如果僅是單一的實驗參數篩選，應用分辨度較低的設計即可滿足要求，如完全要因設計和部分要因設計。部分要因設計較完全要因設計分辨度低，實驗次數少，所產生信息量也較少。分辨度為Ⅲ的部分要因設計實驗次數最少，但不能檢測各種交互作用的效果。

在工藝篩選優化過程中，所涉及因素很多，從眾多因素中篩選出對評價指標產生顯著影響的主要因素，可選用完全要因設計、部分要因設計或Plackett－Burman設計法進行設計。所有設計中各因子均為高、低2個水平，又稱雙水平篩選設計，可用較少的實驗次數篩選大量的因子。因子數為2～4個時可選完全要因設計，通常因子數目達4個以上時多選用分辨度較低、實驗次數較少的部分因子設計或Plackett－Burman設計。如楊冀艷等[7]用Plackett－Burman設計對影響荷葉總黃酮得率的因素進行了評價，篩選出具有顯著效應的因素，即乙醇濃度、液固比和提取次數，然后用響應面分析法確定了主要影響因素的最佳提取條件為乙醇濃度67%、液固比34∶1（V/m），提取3次，在此條件下荷葉總黃酮得率的預測值可達3.19%，實測值為3.17%，兩者較接近。

部分因子設計時應根據實驗需要及因子數設計適當的 p值，通常 p值的不同有時對結果無顯著影響。但因子數量一定時并不是實驗次數越少越好，在進行實驗設計時需要考慮標準誤差，其值與自由度有關。自由度較低時，t值、ME及 SME均偏高，所得結果可能會與相同情況下自由度高時有差異。另外，實驗次數較少時，每次實驗響應值差異明顯，變異系數較大，也會對結果產生一定影響[8]。

篩選出對響應值具有顯著影響的各因子后，需要進一步通過優化設計找出最優值。通常選擇響應曲面設計中的中心復合型設計或Box－Behnken設計，找出靶向、最大化或最小化響應值。如吳大章等[9]采用Box－Behnken設計優化紫蘇葉揮發油－β－環糊精包合物制備工藝，得到優化制備工藝制得紫蘇葉揮發油－β －環糊精包合物的平均包合率為（75.8±0.9）% ，收得率為（73.13 ±1.2）%，預測性良好。若同時有數個響應值，需根據實驗要求設定每個響應值的重要程度，得出最優值，以滿足各響應值的需要[10]。

5 結語

DOE發展至今已涉及多個領域，國外制藥工藝的篩選、優化及驗證中也已廣泛應用，但目前國內報道很少。一方面，可能是因為DOE不僅需要專業知識，還需要一定的數學及統計學知識；另一方面，DOE是對各實驗參數一個系統、全面的篩選與優化，雖然盡可能地減少了實驗次數，但在某些情況下，工作量仍然非常大。DOE有其獨特的優勢，不僅可以節約時間和成本，而且還可大大提高參數可信度和精確度，值得進一步推廣應用。

參考文獻:

[1]Sucker H.Methoden zum Planen und Auswerten von Versuchen I，Factorial Design，eine Einfuhrung[J].Informationsd，rbeitsgem Pharm，Verfahrenstech，1971，17（1 － 2）:52 －68.

[2]Leuenberger H，Becher W.A factorial design for compatibility studies on preformulation work[J].Pharm Acta Helv，1975，50（4）:88 － 91.

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[5]Box GEP，Wilson KB.On the experimental attainment of optimum conditions[J].J Royal Statistical Society，1951，13（1）:1 － 45.

[6]Montgomery DC，Myers RH.Response Surface Methodology[M].Wiley，New York，1995:176.

[7]楊冀艷，胡 磊，許 楊.Plackett－Burman設計和響應面法優化荷葉總黃酮的提取工藝[J].食品科技，2009，30（6）:29 －33.

[8]Vannecke C，Baré S，Bloomfield M，et al.An experimental design approach to the optimisation of a flow injection analysis method for glycine[J].J Pharm Biomed Anal，1999，18（6）:963 － 973.

[9]吳大章，吳品江，楊 明.設計－效應面法優化紫蘇葉揮發油－β－環糊精包合物制備工藝[J].成都中醫藥大學學報，2009（1）:81－87.

[10]Ragonese R，Macka M，Hughes J，et al.The use of the Box － Behnken experimental design in the optimisation and robustness testing of a capillary electrophoresis method for the analysis of ethambutol hydrochloride in a pharmaceutical formulation[J] .J Pharm Biomed Anal，2002，27（6）:995－1 007.