解磷微生物的分離與篩選

鐘傳青，曹廣祥，黃為一

（1.山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南250101；2.山東省醫藥生物技術研究中心，山東 濟南250062；3.南京農業大學 生命科學學院，江蘇 南京210095）

0 引言

磷作為植物體內有機化合物的主要成分，有利于硝態氮的轉化與利用，為生物固氮所必需，同時能促進植物體內碳水化合物的運輸和淀粉的轉化，因此，磷元素對于植物的光合作用、呼吸作用、脂肪代謝、氮代謝等都是不可缺少的［1］。然而我國耕地土壤中全磷的質量分數在0.2～1.1 g／kg土之間變動［2］，許多土壤磷素嚴重供應不足，大部分磷以難溶態存在，不能被植物直接吸收利用。

微生物廣泛存在于自然界比如土壤、空氣和水等環境中，有的微生物能夠分解或者富集土壤中的有毒物質，如石油烴、農藥、重金屬等［3－6］；有的能夠降解土壤中的纖維素、木質素等［7］；少數微生物能夠固定空氣中的游離氮素［8］，為植物提供營養；或者分泌生長素、激素等刺激植物生長的物質［9－11］。解磷微生物也是眾多土壤微生物中的一種，該類微生物可以分泌磷酸酶及有機酸來促進土壤難溶磷向有效磷的轉化［12－14］，以促進植物的生長發育，縮短開花期，提高作物產量。

相關試驗表明，施用解磷微生物肥料的土壤，其有效磷含量均有所增加［15］。解磷微生物的分離與篩選工作量大，因此建立簡單、有效的篩選模型顯得尤為重要。文中研究從全國部分省份、不同地區采樣，采樣地點涵蓋山東、江蘇、安徽、福建、江西、四川、陜西等省份，同一地區根據土壤類型、植被種類等選取不同地點進行采樣，以從中分離和篩選能夠轉化難溶磷為有效磷的解磷微生物。研究結果表明在解磷微生物分離過程中，選用無機磷固體平板作為初篩模型，根據其溶磷圈有無及直徑大小確定是否具有解磷作用，操作簡便，成本低；然后進一步利用磷礦粉液體發酵試驗為復篩模型確定具有較強解磷效果的菌株，為將其制成微生物菌劑提供了豐富的解磷微生物資源，同時為微生物磷肥的研究與開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從全國部分省份不同類型土壤中采樣，共采集24個樣品；同時選用不同植物種子，以其種皮作為分離解磷微生物的樣品來源。

1.2 培養基

（1）培養基A采用0.25 g的七水合硫酸鎂，10.00 g的葡萄糖，0.10 g的氯化鈣，2.00 g的酵母膏，1000 mL的蒸餾水，15～20 g的瓊脂，105℃滅菌30 min。另外將已滅菌的1 mL 10%的磷酸二氫鉀溶液與10 mL 10%的氯化鈣溶液混合，待出現大量白色沉淀后加入50 mL已滅菌的培養基A，并用0.1 mol／L的氫氧化鈉溶液調節 pH值至 7.0，最后倒平板。

（2）培養基B采用0.30 g的七水合硫酸鎂，0.03 g的七水合硫酸亞鐵，0.03 g的一水合硫酸錳，5.00 g的磷酸鈣，1000 mL的蒸餾水，pH值為7.0～7.5，20 g的瓊脂，105℃滅菌30 min。

（3）培養基 C采用10.00 g的蛋白胨，5.00 g的牛肉膏，5.00 g的氯化鈉，1000 mL的蒸餾水，pH值為7.2～7.4。121℃滅菌20 min。

（4）培養基 D采用10.00 g的葡萄糖，0.50 g的硫酸銨，0.30 g的氯化鈉，0.30 g的氯化鉀，0.30 g的七水合硫酸鎂，0.03 g的 七水合硫酸亞鐵，0.03 g的一水合硫酸錳，1000 mL的蒸餾水，5.00 g的磷礦粉，pH值為7.0～7.5，105℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 解磷微生物的分離與初篩

稱取10.00 g的待測土樣，在超凈工作臺內將稱好的土樣放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，28℃、200 rpm條件下振蕩30 min后進行梯度稀釋，在培養基 A固體平板涂布后28℃倒置培養48 h。將其中生長較快的微生物單菌落劃線在培養基B固體平板上，鏡檢觀察菌體形態是否一致，同時記錄各菌株的生長狀況、菌體形態以及對無機磷的利用情況。

1.3.2 解磷微生物的復篩

（1）種子液制備

將初篩時生長較快、溶磷圈較大的菌株進行活化，經鏡檢合格后將其接入裝有50 mL培養基C的三角瓶中，28℃、200 rpm培養48 h后備用。

（2）磷礦粉液體發酵

按照10%接種量重新接入含有50 mL培養基D的三角瓶中。分別設空白（接入空白培養基D）、接滅活菌（接入含有等量菌體的滅菌發酵液）、接活菌三個處理，每個處理再設三個重復。將各三角瓶放于200 rpm的搖床上28℃下培養7 d。

（3）發酵液中可溶性磷含量的測定

發酵結束后將所有錐形瓶121℃滅菌40 min，加兩滴6%H2O2后放入60℃水浴鍋中水浴48 h，定量濾紙過濾后將其定容至55 mL。吸取15 mL濾液，4000 rpm離心10 min，吸5～10 mL上清于50 mL容量瓶中，同時另取容量瓶，吸取不同體積的標準溶液，將樣品及標準溶液加水至30 mL。滴加兩滴二硝基酚指示劑于上述容量瓶中，再加4 N氫氧化鈉溶液至溶液變黃后滴加2 N硫酸1～2滴使其剛剛褪色。加5 mL鉬銻抗試劑后加水定容，混勻。25～30℃顯色0.5 h，用分光光度計700 nm進行比色，計算并記錄有效磷的含量。

2 結果與分析

2.1 解磷微生物的分離

從微生物分離結果來看（見表1），在采集的土樣中，解磷微生物數量較多，以細菌為主，其次為霉菌與酵母，解磷微生物種類豐富。菜園土與種子表面所含解磷微生物種類較多，可能是因為菜園土有機質豐富，能夠給解磷微生物提供碳氮源及其他營養成分。不同類型、不同省份來源的土壤樣品中解磷微生物種類與數量均不同，究其原因可能是土壤類型不同，然而樣品有效磷總量與解磷微生物數量不呈正相關。為能夠從中篩選出高效解磷微生物，滿足植物對磷的需求，還需從以上微生物中篩選出解磷能力較強的微生物，制成微生物菌劑，用于農業生產。

2.2 解磷微生物的初篩與鑒定

將分離出的解磷菌株在培養基B上劃線，根據其生長速度、溶磷圈大小等篩選出生長較快、解磷效果較好的菌株。在平板上生長48 h的部分微生物菌落特征如圖1所示，括號內是根據菌株形態學與生理生化特征研究進行初步鑒定，將菌株鑒定到屬的結果。結果表明：由模型分離出的解磷微生物有細菌、霉菌、酵母等，這些微生物能夠溶解培養基中的難溶磷，使平板產生透明溶磷圈。溶磷圈是解磷微生物的特征之一，有溶磷圈的微生物能夠溶解培養基中的難溶磷，從而產生透明圈；溶磷圈的大小與其生物量有關。培養基A能夠產生磷酸三鈣、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣，以及少量的氫氧化鈣，因此如果能夠在培養基A上產生透明圈，說明該微生物能夠溶解其中的沉淀，具有解磷能力。

表1 不同來源解磷微生物的數量和種類分布

2.3 解磷微生物的復篩

部分溶磷微生物的復篩結果見表2。微生物的解磷能力需要通過復篩試驗進一步確定其對難溶磷的溶解能力，初篩得到的解磷微生物，能夠溶解培養基A產生的磷酸三鈣、磷酸氫鈣等，如果微生物能夠分泌酸，也會產生透明圈；另一方面，有的解磷微生物雖然不能溶解磷酸三鈣，也有可能對其他難溶磷比如磷酸鐵、磷酸鋁等有溶解效果，因此需要進一步通過復篩試驗確認其解磷效果。接滅活菌是為了排除因接菌處理帶入的微生物量磷及其代謝產物引起難溶磷的溶解，接菌處理有效磷含量與接培養基對照的比值反應了該微生物的溶磷效果。經分析可知，P17、Y3、P10、P103、F4等菌株溶磷效果均較好。培養基D中的磷礦粉，可以更換為其他難溶性磷源，從而確認待測微生物對不同難溶磷的溶解效果。

圖1 樣品中分離出的解磷微生物（a）霉菌 P103（木霉屬）；（b）霉菌 P128（曲霉屬）；（c）霉菌 F4（青霉屬）；（d）酵母Y3（紅酵母屬）；（e）細菌P10（短桿菌屬）；（f）細菌P17（芽孢桿菌屬）

表2 溶磷微生物的復篩結果

3 結論

文章從來自全國各地26個樣品中分離出2000多株解磷微生物，確立了能夠有效分離解磷微生物的篩選模型。這些解磷微生物包括細菌、霉菌和酵母等，其中菜園土中有機質含量高，解磷微生物數量較多，四川苗圃菜園土中解磷微生物高達168 CFU／mL；種子表皮如大豆表皮中解磷微生物數量高達138 CFU／mL。不同省份、不同類型的土壤樣品中解磷微生物種類和數量存在顯著差異。通過解磷微生物的初篩和復篩模型分別篩選到木霉P103、曲霉P128、青霉F4、短桿菌P10、紅酵母Y3和芽孢桿菌P17等多株高效解磷微生物，對于溶磷效果較好的微生物，需要進一步研究其是否具有植物病原性，以及是否能夠分泌促進植物生長的代謝產物與激素等，為將其用于實際農業生產奠定理論基礎。

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