小鼠肝臟大部分切除后改良再生模型的建立

施國明 蔡加彬 俞靜嫻 柯愛武 董兆如 張弛 張鵬飛 邱雙健 孫惠川 周儉 樊嘉

(復旦大學附屬中山醫院肝外科，上海 200032)

小鼠肝臟部分切除(partial hepatectomy，PH)模型是研究肝臟再生、急性肝損傷及肝腫瘤發生等的常用模型。此類模型的理想要求是:動物存活率高、可操作性強、重復性好、操作時間短等［1-4］。目前，國際上采用顯微技術切除小鼠2/3肝臟的成功率為96%［5-6］。本研究在傳統結扎法基礎上制作小鼠肝臟大部分切除的改進型模型，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司);6-0 proline縫線(美國強生生物公司)。

1.2 實驗動物 8～10周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠50只(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，體質量(30±2)g，隨機分為實驗組(n=30)、對照組(n=10)和空白組(n=10)。小鼠于恒溫(21～22℃)動物房中飼養，實驗期間小鼠自由飲食及飲水。

1.3 手術操作方法 用0.9%氯化鈉溶液配制1%的戊巴比妥鈉溶液，腹腔注射10 μL/g麻醉小鼠，將麻醉后的小鼠取仰臥位固定于手術臺，腹部剃毛，用聚維酮碘消毒。用剪刀沿小鼠兩下肋弓連線(腹部中部)偏左的位置橫行剪開2.0～3.0 cm切口，全層切開腹壁，如腹壁動脈出現活動性出血，則用6-0 proline縫線縫扎止血;助手用眼科鑷向上輕輕牽引肋弓，并剪離肝鐮狀韌帶;用干棉簽輕輕牽引肝左外葉、肝中葉，用眼科剪離斷肝胃韌帶、左外葉與右側膈肌韌帶、肝左外葉與右腎間的肝腎韌帶等，最后完全游離肝左外葉和肝中葉;用6-0 proline縫線經肝中葉與肝右葉間的肝裂隙環繞肝左外葉和肝中葉的共同肝蒂，用6-0 proline縫針在肝蒂上方0.2 cm處穿右中葉肝表面，并用縫線結扎肝蒂，待肝左外葉和肝中葉顏色變暗紅，在結扎線上方0.2 cm處切除小鼠肝臟的左外葉、左中葉和右中葉;檢查肝切面有無滲血;用3-0尼龍線將小鼠腹肌、皮膚逐層縫合，消毒切口，皮下注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液。將手術后的小鼠采取右側臥位，置于干燥柔軟的紗布之上，在37℃的熱板上復溫至小鼠蘇醒。術后3 d、7 d、14 d，分別取10只小鼠，用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后處死，觀察肝臟再生情況、稱肝臟質量;觀察術后14 d時小鼠存活情況。對照組小鼠的處理:開腹，用眼科剪游離與肝臟相連的韌帶后，對小鼠進行切口縫合消毒，術后7 d處死。空白組小鼠處理:未行手術處理，直接麻醉后處死，觀察肝及各肝葉質量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16軟件進行統計學處理。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠肝臟大部分切除術后存活情況 成功制作改良C57BL/6小鼠肝臟大部分切除模型。小鼠肝總質量(1.5±0.04)g;其中，肝左外葉和肝中葉(包括肝右中葉、肝左中葉)質量(1.0 ±0.02)g，占肝總質量的66.7%。因此，切除小鼠肝左外葉和肝中葉可以制備肝大部分切除模型。在小鼠肝大部分切除的手術過程中及手術后14 d內，小鼠存活率100%(30/30)。

2.2 小鼠肝再生情況 小鼠肝左外葉和肝中葉切除后，小鼠肝臟質量逐漸增加，術后第3天小鼠肝質量達原肝總質量的58.2%，術后第7天小鼠肝質量達原肝總質量的78.0%，術后第14天小鼠肝質量恢復至切除前原肝總質量的93.2%。

3 討 論

制備小鼠肝臟大部分切除后再生模型是研究肝臟再生的基礎，目前國內外報道有4種小鼠肝臟大部分切除后再生模型的制備方法，包括傳統大部結扎法［7］、止血夾法［8］、基于血管定位的肝實質保留法［9］和基于血管定位的顯微手術法［10］。這些模型各具特點，其中以傳統大部結扎法最為經典和常用。Mitchell等［7］在傳統大部結扎法中分步依次切除肝左外葉和肝中葉，小鼠手術死亡率為零，但這種方法操作時間較長(15～20 min)。當肝中葉和左外葉一并結扎時，該方法易致下腔靜脈狹窄和肝臟充血，小鼠手術死亡率較高。止血夾法，即在傳統結扎法中用鈦金屬止血夾代替絲線，雖然手術時間明顯縮短，但仍可能引起下腔靜脈狹窄和肝臟充血，導致小鼠手術中死亡。血管定位的肝實質保留法和顯微手術法雖然可顯著降低因結扎導致的下腔靜脈阻塞的風險，與臨床肝段切除術更接近，但這兩種手術方法需要顯微外科設備，技術要求較高，且手術耗時較長，不易推廣。

本研究在傳統大部結扎法的基礎上，采用6-0 proline縫線環繞肝左外葉和肝中葉的共同肝蒂，并穿肝右中葉淺部固定繞肝蒂線，結扎并切除肝左外葉和肝中葉。這一技術的優點在于:(1)既可以避免傳統結扎法因結扎位太高而導致的下腔靜脈狹窄，又可以防止因結扎線脫落致大出血，小鼠的成活率100%;(2)結扎一步完成，操作簡單，耗時短(10～12 min);(3)不需顯微器械和技術，易于推廣。這項技術的缺點是術中用6-0 proline縫線代替傳統大部結扎法應用的絲線，成本相對較高。

本研究發現，切除小鼠肝左外葉和肝中葉后，肝臟出現代償性增生，術后第7天可恢復至原肝總質量78.0%，術后14天恢復至原肝總質量93.2%。因此，本研究建立的小鼠肝臟大部分切除后再生模型完全符合肝臟再生研究的要求，可應用于肝再生及肝腫瘤發生的分子機制研究。

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［4］Haga S，Ozaki M，Inoue H，et al.The survival pathways phosphatidylinositol-3 kinase(PI3-K)/phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)/Akt modulate liver regeneration through hepatocyte size rather than proliferation［J］.Hepatology，2009，49(1):204-214.

［5］Greene AK，Puder M.Partial hepatectomy in the mouse:technique and perioperative management［J］.J Invest Surg，2003，16(2):99-102.

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［8］Nikfarjam M，Malcontenti-Wilson C，Fanartzis M，et al.A model of partial hepatectomy in mice ［J］.J Invest Surg，2004，17(5):291-294.

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