孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測在唐氏綜合征產前診斷中的應用

趙光堅

（廣東省廣州市天河區婦幼保健院，廣東 廣州 510627）

孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測在唐氏綜合征產前診斷中的應用

趙光堅

（廣東省廣州市天河區婦幼保健院，廣東 廣州 510627）

目的探討檢測孕婦血漿中胎兒游離DNA在診斷唐氏綜合征中所發揮的作用。方法隨機選取2011年2月至2012年2月在我院進行產前檢查的孕婦40例，其中包括正常產檢、高齡或唐氏綜合征需實施羊水穿刺的高危孕婦等，分為正常男胎妊娠組15例，正常女胎妊娠組13例，唐氏綜合征男胎妊娠組12例。通過實時定量的PCR技術，對孕婦血漿中胎兒游離DNA水平變化進行檢測比對。結果正常男胎妊娠組及唐氏綜合征男胎妊娠組均檢測出DYS14基因及β-actin基因，正常女胎妊娠組因無Y染色體，未檢出DYS14基因。正常男胎妊娠組的DYS14基因定量數值為（31.9±17.6）GE/mL，范圍分布為23～66 GE/mL，而唐氏綜合征男胎妊娠組的DYS14基因定量數值為（74.6±31.2）GE/mL，范圍分布為56～108 GE/mL。結論采用實時定量的PCR技術，對孕婦血漿中胎兒游離DNA進行檢測，是一種較為操作快捷、經濟合理的非創傷性產前篩查。

唐氏綜合征；胎兒；游離DNA；產前檢查；PCR

唐氏綜合征，又名21三體綜合征或先天愚型，是一種最為常見的先天性染色體非整倍體遺傳疾病，多發于高齡產婦，發病率約在1/600～1/800，此類新生兒往往面容特殊，存在較為嚴重的智力障礙，并伴有先天性心臟病等各類畸形病癥，并增大了患有白血病的概率，由于尚無切實有效的治療方法[1]，容易給家庭帶來較大的經濟壓力以及精神痛苦，也容易給社會帶來沉重的負面效應，因此較為切實可行的有效措施是出生干預。本文通過使用實時定量的PCR技術，對孕婦血漿中胎兒游離DNA水平進行測定，探討一種方便快捷、經濟合理的非創傷性產前篩查方法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2011年2月至2012年2月在我院進行產前檢查的孕婦40例，其中包括正常產檢、高齡或唐氏綜合征需實施羊水穿刺的高危孕婦等，分為正常男胎妊娠組15例，正常女胎妊娠組13例，唐氏綜合征男胎妊娠組12例。三組孕婦平均年齡均為（30±4）歲，平均孕周為（19±3）周，均未有妊娠合并癥且均為初產。

1.2 檢測方法

1.2.1 制備樣本

抽取5 mL孕婦外周血，置入含有乙二胺四乙酸抗凝劑的無菌管內，離心10 min，轉速設定為2000轉/分，將上層血漿吸取置入無菌Eppendorf離心管內，離心10 min，轉速設定為13000轉/分，再將上層血漿吸取分裝，置入-80 ℃的冰箱中凍存備用。

1.2.2 提取胎兒游離DNA

取出待檢的血漿400 μL，采用德國Qiagen公司生產的DNA提取試劑盒進行DNA的提取，并使用緩沖劑50 μL洗脫每份DNA標本。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測（Taqman探針法）

分別對DYS14基因以及β-actin基因進行擴增，操作方法為：DYS14基因：溫度94 ℃，共計用時5 min，循環數為40次，其中94 ℃變性15 s，退火/延伸溫度55 ℃ 15 s，60 ℃ 50 s；β-actin基因：溫度94℃，共計用時5 min，循環次數為 40次，其中94 ℃變性15 s，退火/延伸溫度60 ℃，時間60 s。每完成1個循環，自動進行1次熒光值檢測。

各反應管中熒光信號抵達預先設定好的熒光閾值時所需要的循環數即為CT值，每一模板的CT值同此模板的起始拷貝數對數呈線性關系，通過起始拷貝數已知的標準品進行標準曲線的制作，并利用標準曲線，根據待測樣本測定出的CT值確定出樣本的DNA含量，然后以每個細胞中6.6 pg DNA為基準，將每毫升血漿中含有的DNA拷貝數換算出來，單位為GE/mL[2]。

1.3 統計學處理

采用SAS 9.0軟件包進行數據處理，通過t檢驗。

2 結 果

3組孕婦均檢出β-actin基因。15例正常男胎妊娠組和12例唐氏綜合征男胎妊娠組均檢出DYS14基因，特異性和敏感性均達到100%。正常女胎妊娠組由于不存在Y染色體，未能檢出 DYS14基因。其中正常男胎妊娠組的DYS14基因定量數值為（31.9±17.6）GE/mL，范圍分布為23～66 GE/mL，而唐氏綜合征男胎妊娠組的DYS14基因定量數值為（74.6±31.2）GE/mL，范圍分布為56～108 GE/mL（P＜0.01）。

3 討 論

3.1 游離DNA的發現及來源

幾十年前，已有研究人員發現人體的外周血中存在著微量游離核酸，不久之后，通過腫瘤患者的外周血檢測出具備腫瘤特征的游離DNA，并證明大多數游離DNA來自腫瘤細胞[3]。而在妊娠這一過程中，胎盤滋養層浸潤子宮壁與腫瘤細胞侵入的機制極為相似，差異在于胎盤滋養層的浸潤具備空間及時間特性。從免疫學的角度來看，胚胎和母體的關系，也與腫瘤和機體的關系相類似，在這一發現的啟發下，研究人員推測，在孕婦的外周血腫應同樣存在著胎兒的游離DNA，在隨后的研究中，成功地采用實時熒光定量PCR技術，從孕婦血漿中的游離DNA中擴增獲得男性胎兒的SRY基因序列，證明胎兒的DNA能夠以游離DNA的狀態進入孕婦的外周血循環中，并穩定存在[4]。

在進一步的研究中，研究人員發現，胎兒游離DNA的來源以及釋放機制大致包括下列3種：①進入孕婦外周血的胎兒有核細胞凋亡，釋放游離DNA。這部分細胞包括淋巴細胞、有核紅細胞、粒細胞等，進入情況包括滋養層基膜及絨毛毛細血管的內皮組織等幾種類型，在這一過程中，胎兒的有核細胞可能出現凋亡。然而經過進一步檢測發現，孕婦外周血中含有的胎兒有核細胞數量較少，而血漿中的游離DNA含量卻較為豐富，尤其是早產孕婦的血漿中，胎兒的有核細胞數量未見增加，游離DNA的含量卻有顯著的增高，分娩2 h后，胎兒游離DNA便全部消失，胎兒有核細胞卻能夠在母體血漿中存活27年，因此孕婦血漿中源自胎兒有核細胞的胎兒游離DNA比例較小；②通過母胎界面進入孕婦外周血。經檢測羊水中胎兒游離DNA的濃度較孕婦血漿中的濃度高近200倍，但臍血漿中母源性DNA的含量在胎兒血循環中總游離DNA的比例平均僅為0.9%，而孕婦血漿中的胎兒游離DNA含量占母體血循環中總游離DNA的比例平均為14.3%，因此即便胎兒游離DNA能夠穿過胎盤，也不可能是孕婦血漿中胎兒游離DNA的主要來源；③胎盤滋養層的細胞凋亡，釋放胎兒游離DNA。胎盤滋養層是一種胎源組織，承擔著母體和胎兒間物質交換的作用，當孕期為4周時，母體血液將滋養層的間隙完全充滿，令滋養層細胞能夠侵入子宮基層，故而合體滋養層細胞便有可能深入母體血液之中，在整個妊娠期間，胎盤細胞均在不斷凋亡，而超過50%的凋亡細胞是滋養層細胞，這是由于胎盤在妊娠早期時所處的環境始終相對缺氧，因此造成大量的滋養層細胞因缺氧而凋亡，釋放出的膜包裹凋亡小體中含有大量DNA。由此可見，孕婦血漿中胎兒游離DNA的主要來源，便是凋亡的胎盤滋養層細胞。

3.2 胎兒游離DNA的制備分析

本次研究通過兩步離心法對待測樣本進行處理，分第一次離心將血漿及紅細胞、淋巴細胞等成分沉淀分離開來，第二次利用超高速離心的方法，將血漿中滯留的少量細胞成分完全分開，獲得純凈的血漿樣本，確保了在產前篩查以及診斷過程中樣本的可靠性，同時證實，利用孕婦血漿中的胎兒游離DNA進行產前篩查以及診斷，比使用胎兒細胞更加具有優勢。

使用Taqman探針法的實時熒光定量PCR技術，能夠實時監測每一次的PCR循環，對樣本起始模板中拷貝數量的測定更加準確，與傳統PCR技術相比，避免了以終產物做定量測定而造成的偏差。同時，由于Taqman探針的靈敏性和特異性極高，假陽性的發生率較低，因此使測定工作更加準確、高速。此外，通過本次研究發現，利用實時熒光定量PCR操作便捷、使用安全、污染度低、高自動化、高通量、高效率，能夠在2～3 h內完成近百個樣本的定量分析工作，適合大規模的產前篩查及病情診斷工作。

在本次對于唐氏綜合征男胎妊娠的臨床診斷工作中，采用孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測的方法，檢測結果為（74.6±31.2）GE/mL，與正常男胎妊娠組的（31.9±17.6）GE/mL相比，高出2～3倍，由此可以證實，唐氏綜合征男胎妊娠組孕婦血漿中的胎兒游離DNA的含量會出現明顯的增加，結合孕婦外周血中胎兒游離DNA來源的研究可以得出結論，檢測胎兒游離DNA能夠作為篩查和診斷唐氏綜合征的候選指標。

綜上所述，采用實時熒光定量PCR技術對孕婦血漿中胎兒游離DNA的檢測，具有準確、便捷、安全、高效、高通量等諸多優勢，值得在臨床診斷及檢測工作中大力推廣。

[1] 宋桂紅,田立霞.胎兒有核紅細胞在產前診斷中的應用[J].國際生殖健康計劃生育雜志,2008,27(4):237-239.

[2] 李子軍.胎兒有核紅細胞與無創性產前診斷[J].國際婦產科學雜志,2008,35(6):398-401.

[3] 李敏清.絨毛活檢在產前診斷中的應用[J].廣西醫科大學學報,2008,25(6):978-980.

[4] Engel K,Plonka T,Bilar M,et al.The correlation between clinical characteristics of pre-eclampsia and the concentration of fetal DNA in maternal circulation[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2008,139(2):256-257.

Detection of Pregnant Women Cell-free Fetal DNA in Plasma in the Application of the Prenatal Diagnosis of Down's Syndrome

ZHAO Guang-jian
(Guangzhou Tianhe District MCH Hospital, Guangzhou 510627, China)

ObjectiveTo evaluate the detect pregnant women cell-free fetal DNA in plasma of the role in the diagnosis of down syndrome.MethodsRandomly selected from February 2011 to February 2011 in our hospital antenatal examination of pregnant women 40 cases, including normal prenatal, old age or down syndrome need to implement an amnio high-risk pregnant women, divided into normal male pregnancy group and control group, 15 cases of normal female pregnancy group of 13 cases, 12 cases of down syndrome male pregnancy group. Through real time quantitative PCR technology for pregnant women to detect cell-free fetal DNA in plasma level changes.ResultsNormal male pregnancies and down's syndrome male pregnancy group were detected DYS14 gene and beta actin, normal female pregnancy because there was no Y chromosome, DYS14 gene was not detected. Normal male pregnancy group DYS14 gene quantitative values for GE/mL (31.9±17.6), the scope of distribution of 23-66 GE/mL, and down syndrome pregnancy group male DYS14 gene quantitative values for GE/mL (74.6±31.2), the scope of distribution for 56-108 GE/mL.ConclusionUsing real-time quantitative PCR technique, cellfree fetal DNA in plasma were detected for the pregnant woman, is a more efficient, economic and reasonable operation of non invasive prenatal screening.

Down's syndrome; Fetuses; Cell-free DNA; Antenatal examination; PCR

R714.53

B

1671-8194（2014）16-0011-02