體外培養細胞生物節律研究進展

肖 邦，崔淑芳

(第二軍醫大學實驗動物中心，上海 200433)

1 生物節律概述

1.1 生物鐘的組成

生物節律是指機體的活動隨時間的變化所表現出來的規律，主要有日節律、月節律、年節律等。其中，我們平時所說的節律一般是日節律又稱晝夜節律。節律生物鐘由三部分組成：校準時間的輸入途徑、產生節律信號的中央振蕩器、影響生理及行為節律的輸出途徑。在大部分的生物體，包括哺乳動物，光周期是起節律誘導作用的最主要環境因素。視網膜的光感受器細胞感知的光信號通過一條被稱為視網膜下丘腦的路徑傳遞給視交叉上核(SCN)的神經元。SCN內含有哺乳動物最主要的振蕩器起搏點。

除了SCN的中樞起搏器外，其它外周組織諸如心臟、肝、腎、胚胎組織和孤立的細胞中內在振蕩器在也相繼被發現[1-2]，由此認為自主節律生物鐘在機體的每個細胞中都存在。科學家構建生物鐘基因(PERIOD2)與熒光素酶融合蛋白(PERIOD2：LUC)來研究小鼠生物節律的動力學特征發現，外周組織在離體的情況下具有保持節律震蕩超過20個循環的能力。并且，外周器官在生物節律的周期長度和時相上具有組織特異性[3]。

1.2 生物鐘的分子機制

無論是中樞生物鐘還是外周生物鐘，振蕩器是其最為關鍵的部分，它是由一組呈近日節律表達的基因(CLOCK、BMAL1、PER、CRY、DEC等)及其編碼的蛋白質(CLOCK、BMAL1、PER、CRY、DEC等)組成。在這個振蕩器中異二聚體轉錄因子CLOCK-BMAL1驅動PER和CRY的自身抑制因子PER和CRY蛋白的表達。CLOCK-BMAL1的再活化發生在PER和CRY蛋白更新幾個小時之后[4]。進一步研究發現，TRAP150(甲狀腺激素受體相關蛋白150)是CLOCK-BMAL1的激活因子，其把CLOCK-BMAL1與靶基因啟動子聯系起來，可以促進CLOCK-BMAL1與靶基因的結合[5]。Cao等[6]證明，機體通過mTOR/4E-BP1信號通路對SCN生物鐘傳輸及同步化過程進行調控。科學家最新的研究發現，真核生物生物節律的保持存在轉錄調控循環之外的機制—氧化還原平衡節律[7]。進一步的研究證實在生物進化的過程中過氧化物酶蛋白是保守的生物鐘標志分子[8]。

2 體外培養細胞的生物節律

2.1 視交叉上核神經元細胞生物節律

SCN內含有哺乳動物最主要的振蕩器起搏點，體外培養的SCN神經元的神經沖動發放頻率同樣保持節律性。研究人員通過微陣列法體外培養新生大鼠SCN神經元細胞發現，單個SCN神經元具有維持自主節律性震蕩幾天或幾周的潛能；同時，可逆性地阻斷神經元細胞的神經沖動發放2.5 d后，還具有節律性，而且阻斷前后其生物節律的相位沒有發生改變[9]。另外，研究還發現一個培養單元中的神經元細胞盡管具有許多功能性的突觸，但是每個神經元細胞表現出的節律性行為并不是同步的；進一步的研究顯示，體外培養的SCN神經元細胞系(SCN2.2細胞)不僅表現出生物鐘基因(PER)表達的節律性而且其內源性的2-脫氧葡萄糖攝取行為也同樣具有節律性[10]。

2.2 其他神經元細胞生物節律

除了SCN神經元細胞外，高等生物體的其他神經組織細胞(如視網膜細胞、松果體細胞)在體外培養的條件下同樣表現出節律性的生理性活動(如褪黑色素分泌)。例如，倉鼠的視網膜及雞的松果體細胞在體外培養的條件下，其分泌褪黑色素的活動具有晝夜節律性：在持續黑暗的條件下，褪黑色素至少可以持續5個24 h周期性釋放[11]。Leonardo等[12]選擇8日齡雞胚的原代視網膜細胞來研究細胞中黑素蛋白基因OPN4X、OPN4M，生物鐘基因CLOCK、PER2，乙酰基轉移酶的表達類型。結果發現，在持續黑暗(DD)條件下細胞中上述所檢測基因的轉錄無節律性；而在12 h光照：12 h黑暗(12 L:12 D)的條件下，CLOCK、PER2、OPN4M、乙酰基轉移酶的轉錄具有節律性；并且對于松果體細胞，這種周期活動會隨著光照周期的變化而發生時相遷移，如在12 L：12 D光照周期下，提前或延遲光照6 h都會使細胞的褪黑色素釋放節律發生相應的時相遷移。由此認為，體外培養細胞的光感受器可以介導細胞生物節律根據光周期的變化而發生相應的時相遷移[13]。

2.3 成纖維細胞生物節律

體內無論是中樞SCN還是外周組織器官都有生物節律震蕩器的存在，并且體外培養的神經元細胞依然保持著節律震蕩的特性，后續研究證實體外培養的外周組織細胞同樣也具有生物節律。研究人員在對大鼠成纖維細胞(rat-1成纖維細胞)的研究中發現，血清休克可對rat-1成纖維細胞生物鐘基因(C-fos和Rper)的表達造成短暫刺激，而且生物鐘基因這種刺激性表達可以很好地模擬體內SCN光誘導生物鐘基因的表達。另外還發現，體外rat-1成纖維細胞生物鐘基因短暫的刺激性表達與體內肝臟生物鐘基因的表達相類似[14]。

2.4 干細胞生物節律

干細胞作為一種尚未分化的組織細胞，以其為模型研究生物鐘隨著細胞分化而發生變化對于了解生物鐘的發生、發展具有特殊的應用意義。Inada等[15]的研究證實，原代分離的胚胎干細胞和來源于轉基因小鼠(Per2：Luc小鼠)胚胎的唾液腺細胞的生物鐘基因表達節律性在體外培養的條件會隨著胚胎的發育而發生改變：細胞的生物鐘可以被重編程因子重新編程。另外，Tsinkalovsky等[16]也發現體外培養的造血干細胞生物鐘基因的表達也會隨著細胞的分化而發生改變。在干細胞除了生物鐘基因的表達會隨著細胞分化而發生改變外，細胞的其他活動(如葡萄糖吸收)的節律特征也同樣會發生改變。Paulose等[17]研究發現，未分化的干細胞表現出吸收葡萄糖的節律性而時鐘基因的表達沒有節律性；而干細胞分化后，在所檢測的生物鐘基因中部分時鐘基因呈現節律性表達，并且細胞葡萄糖吸收的節律振幅幅度增強。

2.5 其他外周細胞生物節律

研究較多且成熟的體外培養細胞模型可以使我們對生物鐘的了解更加深入，但是，卻不夠全面，對其他細胞模型的研究可以很好地解決這個問題。研究人員利用血清誘導兩種不同來源(血小板來源、頸動脈來源)的血管平滑肌細胞(VSMCs)后發現，兩種來源細胞的生物鐘基因(CRY1,CRY2,PER1,PER2,PER3和REV-ERBA)呈現明顯的節律性表達。值得注意的是，CLOCK在血小板來源的VSMCs中節律性表達，而在頸動脈來源的VSMCs中沒有呈現節律性表達；并且與頸動脈來源的VSMCs相比，血小板來源的VSMCs中這些時鐘基因(CRY1,CRY2,PER1,PER2,PER3和REV-ERBA)的表達顯著減弱[18]，這一結果提示不同種類或者來源的外周細胞維持生物節律的分子機制可能不同。

3 體外培養細胞生物節律的相關機制

3.1 體外培養神經元細胞生物節律的相關機制

3.1.1 神經元之間通過接觸連接的方式來影響生物節律的維持

基于體外培養的細胞表現出令人驚奇的生物節律，科學家深入地探索了細胞維持其生物節律的分子機制。研究人員通過在神經元和神經膠質細胞中引入示蹤分子(神經生物肽)以及采用對細胞縫隙連接分子—特異性連接蛋白進行免疫標記的方法來對體外培養的SCN細胞之間的縫隙連接在其生物節律產生中的作用進行評價。實驗發現：星型膠質細胞相互之間通過連接蛋白廣泛地連接，而神經元細胞之間以及神經元細胞與星型膠質細胞之間并沒有縫隙連接的存在。這一結果支持了體外培養的SCN神經元細胞自主發放節律性神經沖動是單個細胞的節律性行為的假設[19]。研究進一步證明，生物鐘基因(PER1、PER2和CRY1)是維持SCN神經元細胞生物節律的必須基因，而另外的兩個生物鐘基因(CRY2和PER3)的失活僅僅引起了細胞生物節律周期長度的改變[20]。

3.1.2 神經元之間通過分泌多巴胺來影響生物節律的維持

神經遞質多巴胺及其受體(D1、D2、D4、D5受體)在神經元之間的聯系過程中扮演著極其重要的角色。那么，神經遞質多巴胺在神經元細胞生物鐘的維持中是否同樣也有其重要意義？為此，科學家進行了一系列相關研究。研究人員發現，加入到培養基的多巴胺、多巴胺受體激動劑或者抑制劑對在33℃下培養了24 h的神經視網膜細胞的褪黑色素釋放活動具有顯著影響：濃度為0.1 μmol/L的多巴胺對視網膜細胞褪黑色素的釋放沒有抑制作用，而高濃度的(1～1000 μmol/L)多巴胺卻可以以劑量依賴的方式抑制褪黑色素的釋放。而且實驗進一步證明，多巴胺的這種作用受多巴胺受體(D2/D4受體)介導，D2和D4受體激動劑(100 μmol/L)可抑制褪黑色素的釋放，D2/D4選擇性受體拮抗劑(100 μmol/L)與多巴胺一起加入到培養基可以阻斷多巴胺對褪黑色素釋放的抑制作用。從而推斷在哺乳動物視網膜細胞中多巴胺可能抑制其褪黑色素的釋放，而且這種作用可能是由D2/D4多巴胺能受體介導[21]。

3.1.3 功能性生物鐘的同步化需要谷氨酸鹽的誘導

影響細胞生物節律的神經遞質除了多巴胺外，其他神經遞質(例如谷氨酸鹽)在細胞生物鐘同步化的誘導過程中亦發揮重要作用。Leonardo等[12]證明，在持續黑暗(DD)條件下，谷氨酸鹽能夠誘導CLOCK基因的節律性表達，并可強烈地抑制黑素蛋白基因(OPN4X、OPN4M)的表達，而對生物鐘基因(PER2)及乙酰基轉移酶的轉錄并未產生影響。因此Leonardo推斷功能性生物鐘的同步化需要谷氨酸鹽的誘導。以上的研究表明，神經元細胞之間通過分泌某些信號物質(例如多巴胺、谷氨酸鹽)或者接觸連接的方式來影響生物節律的維持。

3.1.4 其他影響神經元細胞生物節律的分子機制

目前，傳統的神經元細胞生物節律產生及維持機制無法完全解釋某些現象。因此，科學家們開始嘗試從新的方向來闡明其他相關信號轉導機制。Rodriguez等[22]近期研究發現，不同的生物鐘調節性輸入途徑驅動相同的神經活動節律。另外，該小組還發現，相同的離子電流在不同的條件下扮演不同的角色，而不同的電流在相同的條件下也可以扮演相同的角色。據此，Rodriguez開創了一個研究生物鐘機制及其功能調節的新方向。

3.2 體外培養外周組織細胞生物節律相關機制

3.2.1 體外培養成纖維細胞生物節律相關機制

3.2.1.1 神經元的可擴散信號影響成纖維細胞的代謝活動及per基因表達

與體內SCN神經元細胞相似，體外培養的神經元細胞同樣具有分泌信號物質來控制外周組織細胞生物鐘的功能。研究人員證實，體外培養的SCN神經元細胞系(SCN2.2細胞)通過分泌可擴散信號物質(如多巴胺)使與其共培養的成纖維細胞(NIH/3T3細胞)的代謝活動及PER基因表達產生節律性特征：NIH/3T3細胞所獲得節律的時相較SCN2.2細胞的節律晚4～12 h，這和體內發現的SCN與外周組織之間的時相關系相似。而且NIH/3T3細胞生物節律的保持依賴于SCN2.2細胞持續的特異性信號輸出：通過血清震蕩來誘導產生生物節律的細胞不能驅動與其共培養的非處理細胞生物鐘基因(PER1和PER2)的節律性表達。這表明PER、CRY的節律性表達不足以充當起搏器的角色。因此，SCN神經元細胞特異性的信號輸出對于驅動外周組織細胞生物節律是必須的[10]。

3.2.1.2 成纖維細胞生物節律基因的表達需要周圍細胞的旁分泌信號支持

神經元細胞的可擴散信號可以影響與其共培養的成纖維細胞的生物節律，另有研究證實，成纖維細胞生物鐘基因的節律性表達同樣需要周圍非神經元細胞旁分泌信號的支持，而且這種旁分泌信號并不需要具有節律性。而且，周圍其他表現出生物節律的節律性信號并不會對成纖維細胞的原有生物節律(周期和時相)產生影響[23]。

3.2.1.3 細胞內環境可以對生物鐘基因表達水平之間的差異進行補償

在機體的幾乎所有的細胞中，生物鐘都是由生物鐘基因的節律性轉錄環路來驅動的。Matsumura等[24]發現細胞特異性的內環境也會對生物鐘產生影響。他們發現，生物鐘基因表達時相相互之間的關系在外周組織是相似的，然而同一生物鐘基因的表達水平在組織之間的差異卻可達三倍之多。同時，他們還發現，使用不同濃度血清來培養成纖維細胞并不會對其生物鐘基因的表達產生顯著性的影響。據此可以推斷細胞內環境(例如氧化還原反應潛能、代謝物的成分等)可以對生物鐘基因表達水平的差異進行定量的補償。

3.2.1.4 功能性的CRY基因為成纖維細胞產生生物節律所必須

外來的信號是通過影響細胞固有的生物鐘基因以及生物鐘控制的相關基因來調節細胞生物節律的，只有闡明固有生物鐘及其相關基因，才能真正認識其內在的分子機制。研究者采用來源于轉基因小鼠(CRY突變小鼠)的細胞(CRY突變細胞系)以及野生型細胞對比研究體外培養成纖維細胞生物鐘分子機制時發現，CRY蛋白調控著細胞生物節律周期的時間長度，細胞如缺失功能性的CRY基因，則不能產生生物節律[25]，從而初步確定CRY是成纖維細胞的固有生物鐘基因。

3.2.1.5BMAL1的O連接N-乙酰葡糖胺糖基化調節NIH3T3成纖維細胞生物節律

雖然說環境信號及細胞內部代謝過程在協調和整合24 h的生物節律過程中發揮至關重要的作用，但是翻譯后修飾在調節生物鐘關鍵蛋白中也扮演著重要角色。Li等[26]發現，BMAL1存在O連接N-乙酰葡糖胺糖基化修飾，這種修飾可以使其穩定并且增強其的轉錄活性。而抑制BMAL1 O連接N-乙酰葡糖胺糖基化會導致生物鐘基因節律性表達降低。基于O連接N-乙酰葡糖胺糖基化作用對葡萄糖水平敏感，Li認為此種修飾可能是連接機體代謝與生物節律的新機制。

3.2.1.6 組織特異性的PER1/2 和DEC2的相互作用調節成纖維細胞生物節律

在動物體內，細胞生物鐘基因突變而引發的表型變化可以被細胞間的偶聯機制所掩蓋，從而穩定細胞的生物節律。Tsang等[27]通過實驗發現，成纖維細胞生物鐘基因PER和DEC2相互作用的主要方式是協同作用：細胞在缺失PER2的情況下，DEC2使其生物鐘不穩定，并且這種作用具有組織特異性。同時敲除細胞的PER1和DEC2或PER2和DEC2發現其表現出生物節律的能力大大降低，從而得出DEC2與PER相互作用來穩定細胞生物節律周期的結論。

3.2.2 外周組織在細胞和組織的水平上存在著組織特異的節律震蕩同步化因子

研究人員發現SCN中PER2基因的損傷并沒有使外周組織的生物節律消失，而只是引起了動物體組織之間或者是個體之間的生物節律時相不一致。由此研究人員一致認為，外周組織具有自主保持生物節律的震蕩器，同時在細胞和組織的水平上存在著組織特異的節律震蕩同步化因子[3]。

3.2.3 細胞間的相互作用或者腫瘤樣微環境影響腫瘤細胞生物節律

另外，基于前人在研究中的發現：富含腫瘤干細胞(CSCs)的C6神經膠質瘤的生物鐘基因(如PER)的表達具有晝夜節律性，并且這些生物鐘基因在缺乏所有生長因子的培養基條件下表達節律性特別的明顯，Sharma等[28]采用了一種鑒定單個CSCs的方法用于單個細胞節律性行為的分析。結果發現，單層培養的CSCs的Per蛋白的行為—細胞核內定位不具有節律性，所以他們推測細胞間的相互作用或者是腫瘤樣微環境能使腫瘤細胞表現出節律性行為。

3.2.4 外周組織細胞生物節律的其他機制

不同的組織細胞通過合成和分泌不同的信號物質來執行不同的生物學功能，所以生物節律調節也會存在不同的信號機制。Bernat等[29]發現神經性營養因子受體(P75NTR)可以改變時鐘基因在成纖維細胞的震蕩節律。而在另外一項外周破骨細胞的研究顯示，糖皮質激素通過介導外周破骨細胞的生物節律而導致破骨細胞相關基因的節律性表達：糖皮質激素可以使體外培養的破骨細胞時鐘基因和破骨相關基因的節律性表達明顯同步化[30]。Okamura等[31]最近還發現抑制細胞生物鐘基因的甲基化作用可以使小鼠胚胎成纖維細胞生物節律的周期延長。

盡管如此，人們對外周培養細胞生物節律產生及維持機制的了解也僅僅是在外周信號影響和調節以及少數相關基因以及他們的產物上，而對于信號物質是如何影響和調節細胞固有生物鐘基因表達，特別是對其里面所包含的確切信號通路以及由通路構成的復雜網絡機制，目前尚不清楚，并且組織特異時鐘基因的表達也不盡相同。因此，對體外培養的細胞特別是外周組織細胞生物節律還需要更加深入、全面的研究。

4 展望

越來越多的研究表明，體外培養的無論是中樞神經細胞(SCN)還是周圍組織的體細胞(包括癌細胞)都可以表現出明顯的晝夜節律。而且隨著各種類型細胞生物鐘的不斷發現，生物鐘節律振蕩的機制也在不斷地被闡明。借助體外培養手段研究生物鐘的不斷深入將會促進人們對機體內生物鐘復雜機制有一個更新的了解，同時通過體內試驗和體外試驗的結合，生物鐘的調控機制將會逐步被闡明。相信隨著研究的不斷深入，生物節律內在的分子機制終將會被完全揭示。

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