慢病毒載體介導的RNA干擾及其在T淋巴細胞的應用*

杜晶晶， 孫軼華

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150081)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是普遍存在于生物體中的一種序列特異性的基因表達調控方式，它是由小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)介導的特異性降解mRNA的過程[1]。T淋巴細胞是處于非分裂期的細胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要作用，是基因治療中常用的靶細胞。但在RNAi技術中，T淋巴細胞基因轉導效率低而影響了其應用。因此，提高目的基因對T淋巴細胞的轉導效率對于這類疾的基因治療具有重要意義[2]。現將慢病毒載體介導的RNA干擾技術在T淋巴細胞研究中的方法和應用作一綜述。

1 RNA干擾的載體

RNA干擾的應用主要包括：(1)siRNA的設計與制備；(2)siRNA的轉導；(3)RNA干擾效能的檢測。將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子，這樣就能在體內表達所需的siRNA分子，這種方法的優點在于不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默；直接轉導合成的siRNA進入細胞內能夠特異性抑制哺乳動物細胞內目的基因的表達，但siRNA進入細胞后容易被降解且RNAi效應持續時間短[3]。針對這些情況，出現了質粒、病毒類載體介導的siRNA體內表達，但是，質粒載體轉染哺乳動物細胞的效率不如病毒載體，且不能轉染非分裂相細胞。慢病毒載體是常用的病毒載體之一，它是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發展起來的基因治療載體。其特點為免疫原性低， 能感染分裂相和非分裂相細胞，對于一些按常規方法難以轉入甚至無法轉入的細胞，如原代細胞、干細胞等未分化細胞，通過慢病毒介導的方法能夠大大提高基因的轉導效率。慢病毒載體介導的RNA干擾技術就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達的作用相結合，是實現哺乳動物細胞siRNA穩定表達的理想工具[4]。

2 慢病毒載體介導的RNA干擾的作用機制

慢病毒載體介導的RNA干擾的表達載體有兩類：一類分別轉錄有義RNA和反義RNA，兩條鏈在細胞內互補結合生成siRNA；另一類則轉錄短發卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)。其中，shRNA更加常用，其結構主要由慢病毒載體骨架和shRNA表達框組成。shRNA表達框主要包括：RNA聚合酶III(RNA polymerase III，Pol III)依賴的啟動子、shRNA結構序列以及終止子。其中，shRNA結構序列由兩段互補序列相向組成，兩段序列之間有4～10個堿基的中間序列。慢病毒感染細胞后，將此shRNA表達框整合進宿主細胞基因組。shRNA在宿主細胞被轉錄后，兩段互補序列堿基配對結合，中間序列則成為莖環結構。莖環結構可被Dicer酶識別并切除，產生的siRNA將執行RNA干擾[4]。

小RNA是一類新發現的長度為21～25個核苷酸的小分子RNA,它普遍存在于多細胞生物中，是調控RNA的重要分子,根據小RNA的結構和功能大概可分為3類：siRNA、微RNA(microRNAs, miRNAs)和其它小RNA[5]。它的體外制備方式主要有3種：化學合成、體外轉錄及用RNase III 或Dicer酶消化長片段雙鏈RNA制備siRNA。化學合成法最為昂貴，適用于已經找到最有效的siRNA的前提下，需要大量siRNA進行研究時使用；體外轉錄法則用于篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs且經費不十分充裕時。雖然化學合成的siRNA可以不經過任何細胞修飾而直接并入RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)發揮作用，但是依賴Dicer酶產生的siRNA通常比之更有效[6]。shRNA從正義和反義的DNA序列轉錄之后產生長度為19～29的核苷酸片段，中間由一莖環序列分隔，組成發夾結構[7]。因此，shRNA的一個優勢就是它的莖環式二級結構是依賴Dicer酶途徑產生的siRNA[8]；另一個優勢是從DNA結構的穩定表達，另外，長度較短的shRNA也最大限度減少了哺乳動物雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R(PKR)的潛在活化[9-10]，從而限制了廣泛存在的脫靶效應。當然，shRNA也可能通過模擬miRNA從而引起廣泛的脫靶效應[11]。

3 慢病毒載體介導的RNA干擾技術在干擾T淋巴細胞功能中的研究策略

慢病毒載體介導的RNA干擾技術在靜息細胞或活化的難轉染細胞均能實現基因的高效轉移，包括沉默T淋巴細胞的相關基因表達[12]，尤其在CD4+T淋巴細胞，一些基因表達的沉默對于HIV-1復制具有明顯抑制作用，因此，這種技術對于研究T淋巴細胞的一些潛在功能意義重大。該技術的基本應用過程包括：設計和克隆一個shRNA的慢病毒轉移載體；三質粒共轉染293T細胞并濃縮病毒獲得高滴度的病毒顆粒；獲得病毒穩定感染的細胞系[13]；驗證在該細胞系中目的基因的沉默程度。然而，由于各種原因導致靶mRNA的不完全沉默以及實驗控制的不嚴格對翻譯水平的影響，慢病毒介導的RNA干擾技術在人類細胞基因功能分析中的應用在一定程度上受到限制，這些限制主要表現在后2步：能否成功獲得穩定感染的細胞系和能否嚴格驗證RNA干擾程度，以下將重點介紹與此相關的研究策略。

3.1提高慢病毒對T淋巴細胞的感染效率 采用濃縮好的慢病毒顆粒感染T淋巴細胞首先需要確定病毒感染細胞的最適比例，即感染復數(multiplicity of infection，MOI)。在采用慢病毒載體基因轉導技術研究整合素對T淋巴細胞功能調節的相關分子通路時發現,通常MOI值為50時比較合適，同時規范貯存用于實驗的慢病毒顆粒對確保高效感染至關重要，在解凍后感染前慢病毒應始終置于冰上，盡量避免反復凍融慢病毒以確保每次感染細胞時的慢病毒MOI值相差不大。 在使用濃縮好的慢病毒顆粒感染T淋巴細胞時需要提前活化靶細胞，可使用植物血凝素促進T淋巴細胞活化，并且在慢病毒感染細胞的過程中添加白細胞介素-2以維持T淋巴細胞的長期培養[14]。研究發現目前使用Amaxa公司的核轉染技術感染靜息T淋巴細胞，是一種有效的方式，但轉入的基因表達時間短暫[14-15]。

Polybrene是為了促進慢病毒感染靶細胞而常用的一種試劑，它可以增強病毒和宿主間的疏水作用，從而增加感染率[16]。離心感染病毒法是慢病毒感染T淋巴細胞過程中的重要步驟，可以很大程度上增加懸浮細胞(如T淋巴細胞)的感染率[14]。但是，在研究HIV-1病毒時發現，離心介導的增強HIV-1病毒進入細胞不是通過增加細胞與病毒的接觸概率而發揮作用，相反，該過程伴有離心介導的肌動蛋白和絲切蛋白活化，從而增強病毒綁定、進入、DNA整合和核轉移。因此，當采用離心法提高慢病毒對靶細胞的感染率時應結合具體實驗目的謹慎分析數據結果[17-18]。

3.2避免脫靶效應RNA干擾程度主要通過RT-PCR和Westernblotting在mRNA和蛋白水平檢測，但由于二者都是RISC組分，故功能界限并不清晰，且在介導沉默機制上有重疊，因此，在蛋白水平和mRNA水平同時證明表達降低才是傳統意義的RNA干擾。如果只是蛋白水平降低，這很可能只是microRNA相關的轉錄機制參與其中[19]。

由于非目標效應的存在，采取適當的控制措施對于獲得準確的RNA干擾實驗結果非常重要，一個共同的金標準是靶蛋白的再表達和沉默前表型獲救[20]。Miest等[21]曾使用γ逆轉錄病毒載體(gamma-retroviralvectors,MLV)驗證靶蛋白的再表達情況，Llano等則采用穩定的質粒轉染技術同樣達到了目的[22]。當需要siRNA較多時，這種控制尤其重要，甚至需要定量檢測蛋白水平的改變，從而精確估計沉默的程度。另外，當設計了針對mRNA不同區域的多條siRNA，并且證明了它們具有相似的干擾效果時[23]，可以不需要驗證靶蛋白的再表達，RNA干擾的結果已經足夠令人信服。當然，如果是進行大規模的基因掃描時，控制手段必須更加簡化[19]。

為了克服這些缺陷，有人建立了一種單一慢病毒載體，它能夠在同一種細胞中兼顧消耗內源性基因表達和表達抗原標記的抗靶基因siRNA。在人類T淋巴細胞，沉默α肌動蛋白1(RNAi-depletedα-actinin-1)會抑制基質細胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)的趨化性，但是，當同時在T淋巴細胞中表達抵抗RNAi-α-ACTN1(RNAi-resistantα-ACTN1 ，rr-α-ACTN1)時，SDF-1的趨化功能可以被挽救。通過GFP標記rr-α-ACTN1可以檢測到rr-α-ACTN1的亞細胞定位，這一系統不僅提供了對于RNAi內部非目標效應的控制，同時也是潛在的快速分析基因結構功能和基因治療的工具[24]。

4 慢病毒載體介導的RNA干擾技術在T淋巴細胞研究中的應用

現在越來越多的研究人員開始采用慢病毒載體介導的RNAi技術來研究生物體的基因表達。該技術可廣泛應用到包括功能基因組學、藥物靶點篩選、細胞信號轉導通路分析、疾病治療等。

4.1研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發現大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

細胞毒性T細胞相關抗原4(cytotoxicT-lymphocyteantigen4, CTLA4)基因是T淋巴細胞介導的免疫調節中的一種重要基因，它與許多自身免疫性疾病有關，尤其是Ⅰ型糖尿病。通過慢病毒轉基因技術建立小鼠RNAi模型，研究CTLA4自然變異帶來的影響時發現，不同于相應的基因敲除小鼠多器官自身免疫表型，CTLA4表達減少導致的自身免疫性疾病優先集中在胰腺，隨后迅速發展為糖尿病。這揭示了一種潛藏于CTLA4基因缺乏小鼠的淋巴組織增生和多器官自身免疫的特異性，而且容易被忽略，因此慢病毒介導的shRNA與傳統的基因敲除技術相比，更容易發現與CTLA4表達變異相關的人類疾病[25]。

4.2研究信號轉導通路的新途徑 聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號轉導途徑中不同基因的上，下游關系。在炎癥和免疫反應過程中，整合素對T淋巴細胞的黏附和遷移發揮重要作用，為了解T淋巴細胞中整合素發揮作用的具體分子通路，Banerjee等[14]用到了慢病毒載體介導的基因轉移技術，從而有效地研究各個方面整合素的功能，甚至執行全基因組RNA干擾掃描以全面尋找到T淋巴細胞整合素功能的調節者。

4.3開展基因治療的新策略HIV-1的靶細胞有CD4+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、星狀細胞等，其中主要是CD4+T細胞，慢病毒介導的RNA干擾作為一種探索基因功能的有力工具，已廣泛應用于抗艾滋病研究[26-27]。傳統的抗艾滋病藥物主要針對病毒酶發揮作用因而常受到抗藥性的限制，最近發現可以采用艾滋病毒依賴因子，或病毒復制依賴的宿主蛋白為靶點研制藥物。研究證實Tat-SF1作為一種艾滋病毒依賴因子存在于SupT細胞(在許多HIV患者血清中出現的源于CD4+T細胞系并與自身抗體反應的細胞)中，但是它并不是病毒復制最重要的輔助因子且受到抑制時會影響細胞生長，從而表明了檢測HIV-1在持續抑制宿主防御因子表達的細胞中的復制動態及細胞毒性的重要性，繼而使它有望作為艾滋病的潛在治療靶點[28-29]。

許多組織移植需要組織相容性匹配的人類白細胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)以預防移植排斥、降低免疫抑制水平而維持移植物存活時間、減少移植物抗宿主病的風險，尤其是對于骨髓移植更加重要。然而，近期的研究表明利用基因轉移和基因調控技術可能開辟HLA表達水平降低的移植工程。當采用慢病毒介導的shRNA沉默HLA一類及等位基因時可以實現HLA在人類細胞表面高效且劑量依賴性減少，并伴有對同種反應性細胞毒性T細胞的抵抗作用，同時避免主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)被非限制性殺死[30]。

5 總結

慢病毒介導的RNA干擾應用于基因治療是該技術發展的一個大方向。盡管可以采取多種方式控制慢病毒載體轉染過程及避免脫靶效應，但由于T淋巴細胞是一種免疫細胞且懸浮生長，這些條件都決定了它是一種難轉染細胞。因此，提高目的基因對T淋巴細胞的轉染效率至關重要，這也預示著距離該技術大規模臨床應用還有很長的路要走。但是，隨著慢病毒介導的RNA干擾機制的進一步揭示，RNA干擾技術在T淋巴細胞功能研究和臨床治療藥物研究中的應用必將具有更廣闊的前景。

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