子宮內膜異位癥動物模型研究進展

馮 雪,黃 薇

(四川大學華西第二醫院，成都 610041)

子宮內膜異位癥(簡稱內異癥)是育齡期婦女的常見病及多發病，主要表現為慢性盆腔疼痛、痛經和不孕等，但病因和發病機制尚不明確。由于實際操作和倫理學方面的約束，在人體進行內異癥的發病機制和治療研究受到限制，因此，動物模型被廣泛地運用于內異癥的基礎和臨床研究中。動物涉及大鼠、小鼠、家兔、獼猴、狒狒、巴馬香豬、雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)等，其中以嚙齒類、靈長類動物模型研究最多，本文就這兩類最常見的內異癥動物模型研究進展進行文獻復習和綜述。

1 嚙齒類模型

嚙齒類動物繁殖能力強，動情周期短而規律，約4～5 d，因無內膜脫落，不能自發形成異位病灶，但是，將內膜組織移植到宮外如腹腔部位則可形成病灶。依據移植組織來源分為自體移植模型和異體移植模型兩類。

1．1 自體移植模型

1.1.1 自體移植模型的特點：自體移植指將自體或同源性子宮內膜移植于到同種自體或異體免疫活性動物中，常用動物是性成熟的雌性大鼠及小鼠。常見的大鼠有SD或Wistar，小鼠有BALB/C、C57BL等品種。造模方法：切除自體或同種異體子宮，并切成小塊，移植到腹腔內。大多數研究未分離子宮內膜和肌層，而是將兩部分一起移植；也有研究將漿膜、肌層去除，僅移植子宮內膜層的[1]。張春斌等[2]發現大鼠造模后8周異位子宮內膜形態和結構與在位子宮內膜基本相同，病灶外觀呈囊泡狀，并與周圍組織有不同程度的粘連。Korbel等[3]發現移植物的大小會影響病灶的形成和發展，盡管直徑3 mm子宮內膜組織比2 mm組織生長慢，但形成病灶大且囊腫更多。

1.1.2 自體移植模型的應用：有關內異癥類固醇激素及相關調節的研究多采用自體移植模型，為消除大鼠/小鼠發情周期的差異，往往去勢后給予肌注外源性雌激素造模。Burns等[4]發現雌激素受體(ER)α敲除小鼠的異位病灶小且數量少，而ERβ敲除小鼠的異位病灶與野生型小鼠差別不大，說明ERα在介導內異癥的發生過程中占主導地位，ERα和ERβ相互作用可能會對內異癥的發生發揮作用。

此外，自體移植模型也是研究內異癥免疫炎癥機制及治療的良好模型。Umezawa等[5]通過微點陣分析技術檢測ICR 小鼠自體移植模型中移植物附著的腹膜(除去移植物)的早期各基因的表達，發現造模后24 h～96 h，炎性因子、粘附分子、細胞外基質基因呈高表達，而血管生成因子的表達降低，表明早期介導異位病灶形成的是粘附分子和炎癥反應，而非血管生成。Efstathiou等[6]發現不同非甾體類抗炎藥抑制病灶的能力不同，塞來昔布、吲哚美辛、萘普生、布洛芬均有效，以塞來昔布作用最強，而阿司匹林則無效。

內異癥對婦女生育力的影響的機制復雜，可能涉及卵泡發育、受精和著床等方面。Julie等[7]發現Sprague-Dawley大鼠造模后卵巢功能發生改變，形成的卵泡數量減少，黃素化未破裂卵泡增加，胚胎發育異常如染色體錯位、核與細胞質分裂以及自發性流產增加。這些大鼠的雌性子代鼠也表現出類似的生殖異常，推測患子宮內膜異位癥患者的后代可能存在永久的表觀遺傳變化。Lee等[8]發現造模后14周的CD1小鼠的在位內膜基因表達異常，HOXA10表達下降甲基化明顯，胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP1)表達降低，而PGR(α+β)mRNA表達增加且PGRβ/PGR(α+β)的比率增加，說明正常子宮內膜出現在異常位置且形成內異癥后，可以通過信號傳導途徑，導致在位內膜的基因表達發生改變。

慢性盆腔疼痛是內異癥的主要癥狀，疼痛發生機制及治療是近年來的研究熱點。 Alvarez等[9]將大鼠的子宮內膜組織自體移植到腓腸肌中，鞘內注射白介素6受體、神經生長因子酪氨酸激酶受體和腫瘤壞死因子受體mRNA的反義寡脫氧核苷酸后，發現阻斷前兩個因子的表達后可有效降低移植部位的機械痛敏，表明異位病灶產生的痛覺介質是導致內異癥性盆腔疼痛的主要原因之一。

1.2 異體移植模型

1.2.1 異體移植模型的特點：異體移植是將人在位內膜或異位組織移植到免疫缺陷動物體內，動物包括裸鼠、SCID小鼠及NOD/SCID小鼠等。不論是增生期、分泌期還是月經期在位內膜都能成功地移植到裸鼠皮下或腹腔內，形成的異位病灶在宏觀上和組織學上都類似于人異位內膜樣病灶[10]。一般移植 5 d后即可見異位病灶與移植部位牢固粘附 ,常發生在腹壁、膀胱旁脂肪等部位,時間越長 ,病灶與裸鼠組織融合越明顯 ,盆腹腔粘連越重[11]。有研究發現人在位內膜移植到SCID/NOD-SCID小鼠有更高的成活率，4周后也能更好的保持形態學特征和表達類固醇激素受體，因而，實驗周期3周以上時宜選用SCID或NOD/SCID鼠[12]。SCID/NOD-SCID小鼠缺乏T和B淋巴細胞，但有NK細胞活力，而NOD/SCID)/γCnull(NOG)小鼠無NK細胞活力。Kikuchi-Arai M等[13]將生育期婦女的分泌期子宮內膜移植入到去勢的NOD/SCID)/γCnull (NOG)小鼠腹腔內，給予補充雌孕激素模擬人工周期，在組織學的水平上觀察到NOG小鼠在位內膜表現出規律的月經周期，類似人子宮內膜的規律變化。

1.2.2 異體移植模型的應用：基質金屬蛋白酶(MMPs)是細胞外基質降解過程中最重要的一組蛋白酶，它的周期性表達對子宮內膜生長和重建至關重要，同時MMPs表達又受到甾體激素和細胞因子的調節。夏玉芳等[14]研究發現異位內膜較正常內膜MMP-2、VEGF蛋白表達增強,TIMP-2蛋白表達減弱。

血管生成在內異癥發生發展中起重要作用。在異體模型中發現異位病灶血管發生并非來自裸鼠或SCID鼠，而來自于移植物，人子宮內膜在黏附于宿主時保留自身的血管并發揮功能，表明異位病灶的血管生成或血管發生非常活躍[15]。研究發現多巴胺激動劑卡麥角林(CB2)和喹高利特通過阻斷血管生成因子受體2(VEGFR2)發揮抗血管生成作用，從而減小異位病灶的大小[16]。

由于異體移植模型小鼠是免疫缺陷鼠，因此，不用于評估內異癥免疫調節藥物療效的研究。

1.3 嚙齒類模型病灶檢測方法

光學成像技術利用非常靈敏的檢測儀器，可更好的定位和觀察植入組織的生長黏附、無創傷動態檢測異位病灶的形成和發展。目前，綠色熒光蛋白(GFP)生物發光技術在內異癥動物模型中應用最為廣泛，標記子宮內膜組織或細胞方式有2種：腺病毒表達載體轉染和GFP轉基因動物。利用腺病毒表達載體系統標記人內膜組織，產生的病毒滴度高，轉染效率高，且可在體外較長期較穩定表達，但GFP基因轉染入人子宮內膜組織效率較低，而且熒光會隨著時間延長逐漸減弱，熒光大約3～4周后表達減退，因此該模型不太適合長期依賴熒光鑒別的組織[17]。.而增強型綠色熒光蛋白(eGFP)轉基因小鼠同系異體移植模型具有更強的穩定性，其移植的內膜永久表達GFP，而且能清楚地辨別GFP標記的內膜組織[18]。

另外，有學者使用Vevo 770小動物超聲技術檢測小鼠腹腔子宮內膜異位病變，該超聲探頭最高頻率達40MHZ，分辨率達到30μm，能夠很清楚的區分異位囊腫，且操作過程無創、可重復，是一項有前途的診療措施[19]。

1.4 嚙齒類模型的評價

大鼠、小鼠價格便宜、飼養方便、來源廣泛，可以大規模使用同基因的動物進行實驗，并且可以在不同的時間間隙觀察異位病灶，了解不同藥物和治療的效果，可用于研究異位病灶引起機體免疫方面的改變、藥物療效評價和副反應的觀察，但是嚙齒類動物和人類的生殖生理有很多不同，且造模時通常將子宮內膜和肌層一起移植，可能會影響病灶的發展。當評價異位病灶的生長和大小時，肌層會占相當大的部分，不能完全代表異位病灶的內膜情形。異體移植模型可保留人類組織的形態學，對早期研究內異癥發病機制、藥物治療方面更具說服力。但是，由于異體移植選用的是免疫缺陷小鼠，沒有完整的免疫系統，飼養條件高，不能耐受多次手術和采血檢測，并且仍存在不同程度的免疫應答而對移植物發生排斥反應，因而不適于研究環境因素及長效藥物。

2 靈長類動物模型

2.1 靈長類動物模型的特點

靈長類動物與人類的遺傳背景很相似，生殖生理和盆腔解剖也與人類最相近，且有規律月經周期，有月經內膜脫落，是最理想的內異癥模型。但因其價格昂貴、物種稀有，大多是受保護的瀕危動物，所以研究使用往往受到限制。

盡管目前已有靈長類動物自發性內異癥的報道，但是發生率低，且發展緩慢，往往需要較長時間，因此一般都采用人為誘導產生內異癥模型。靈長類模型多選擇狒狒、獼猴等。在早期的研究中，有學者將月經血通過宮頸復位轉移進恒河猴盆腔,或者通過閉塞宮頸增加月經逆流誘導產生內異癥模型[20]。目前大多采用開腹或腹腔注射將內膜組織接種到腹腔，內膜來源于靈長類動物的月經期內膜或切除其子宮來獲取內膜組織。造模時，顆粒狀的內膜組織較內膜上清液成分移植成功率更高[21]。采用腹腔鏡連續觀察狒狒內異癥病灶形成情況，發現移植后1月大多為紅色病灶，隨著病情進展，病灶可變成黑色、藍色或白色等多種顏色，最終病灶可持續生長至接種后15個月[22]。

2.2 靈長類動物模型的應用

早在1996年就有學者在狒狒模型發現輕度內異癥不影響其妊娠率，而II-IV期內異癥動物的生育力下降[23]，近年來關于異位病灶對在位內膜的影響成為研究熱點。Afshar 等[24]將狒狒月經期內膜接種至其腹腔內各個部位，然后于造模后1、 3、 6～7、10～12 和 15～16 月收集分泌中期在位內膜，利用基因芯片技術進行分析，發現術后1月即有4331 個基因表達異常；每個采樣階段均有數個信號通路失調，包括表皮生長因子、 ERK/MAPK 和 PI3/AKT等；造模后15月發現孕激素抵抗更加明顯。說明在位內膜不是固有缺陷的子宮內膜，它受到異位病灶的影響后，導致基因表達發生異常。另有學者發現狒狒模型中異位病灶中端粒酶與核仁素表達增加，γ-H2AX表達缺失，6～12月后在位內膜也出現同樣的改變，說明異位病灶有很強的增殖潛能，同時對在位內膜產生了影響[25]。

靈長類動物模型也是研究內異癥遺傳模式和環境影響因素的最佳模型。越來越多證據提出內異癥有遺傳基礎，基因傾向是發病的高風險。Zondervan等[26]對9個核心家族1602只雌性獼猴進行內異癥發病率的群落和系譜分析，發現內異癥組比對照組的平均血緣系數和同胞患病率增高，說明獼猴發生內異癥具有家族聚集性。Fakis等[27]在獼猴模型中研究芳香胺N-乙酰轉移酶2(NAT2)對多種環境毒物的乙酰化作用及和抗體的結合能力，說明NAT2代謝活性的差異和某些環境污染物與內異癥易感相關。

3 結論

綜上，靈長類動物模型仍然是最適合研究子宮內膜異位癥的模型，因為它最接近人類生理特點，包括盆腔解剖，生殖生理的特點和免疫特征。內異癥動物模型對研究內異癥的發病機制和探索新的治療方案都有極大的價值，但現有的建模方法都有各自的不足之處，因此在設計實驗方法時必須衡量它們的實用性，充分發揮動物模型的優點，更好地揭示內異癥的病因及發病機制，指導臨床實踐。

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