應用微衛星標記對兩個豚鼠封閉群的遺傳學研究

李芳芳，魏 杰，王 洪，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

豚鼠因為其特殊的生物學特性和生理解剖特點，被廣泛應用于各個醫學和藥學的研究領域。目前，國內使用的豚鼠多為Hartley品系，屬于封閉群，遺傳結構呈雜合性[1]，由于缺乏有效地遺傳監測，其實際遺傳背景和遺傳多樣性尚不清楚。為保持豚鼠的基因雜合度及遺傳穩定性，對豚鼠的遺傳質量實行監測成為重要的課題，而開發一套基因組分子標記是檢測的前提[2,3]。微衛星DNA是一類以1-6bp核苷酸為基本序列的多次串聯重復序列，由于重復序列的數目不同，產生了DNA的多態性，又稱簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)或短串聯重復(short tandem repeats)。微衛星標記應用于實驗動物的遺傳檢測已被證明具有獨特優勢和良好前景[4-7]，特別是其高度多態性及位點充足的特點，尤其適用于封閉群的遺傳檢測[8]。

本研究應用篩選獲得的25個多態性微衛星標記結合熒光標記-半自動基因分型技術，對北京的兩個豚鼠封閉群進行了遺傳多態性分析，為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標準的建立提供基礎技術支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

豚鼠為Hartley，分別來自兩個封閉群。A群為1994引自日本，封閉至今，動物36只，許可證號SCXK(京)2009-0017；B群2004年從Charles River引入,動物28只，許可證號SCXK(京)2012-0001。動物使用許可證號SYXK(京)2011-0008.

1.2 主要試劑及儀器

試劑：1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mol/L EDTA-2Na (pH 8.0), 6 mol/L NaI, 50×TAE, 氯仿，異戊醇，異丙醇，乙醇，Taq聚合酶，dNTP，10× PCR buffer，D2000 plus marker，瓊脂糖等，為寶如億(北京)生物技術有限公司產品。

儀器：PCR儀 (Bio-Rad公司)，核酸瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad公司)，離心機(美國Thermo Fisher公司)，電子天平(Mettler GB303)等。

1.3 引物選擇及篩選

根據相關文獻[9-11]，初步選擇多態性好的40個豚鼠微衛星位點進行實驗，通過PCR擴增最終篩選出25個微衛星位點進行研究，引物信息見表1，所有引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成并進行熒光標記。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提取：采取心臟采血，每只豚鼠采500 μL血樣，并立即注入4 mL EDTA抗凝真空采血管中，充分搖勻并編號。參照《分子克隆指南》[12]及Loparev VN等[13]方案，NaI法提取抗凝血基因組DNA。

1.4.2 PCR擴增：25 μL反應體系：滅菌dd H2O 18.3 μL；10× PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL；dNTP (2 mM) 2.0 μL； 上游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；下游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；；模板 (30 ng/μL) 1.0 μL；Taq酶(2.5 U/μL) 0.2 μL。

反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR試劑為寶如億(北京)生物技術有限公司產品。

1.4.3 等位基因分離：2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離產物，篩選出擴增效果好的產物進行STR掃描。共選取三種熒光標記，分別為FAM、HEX和TAMRA。

1.4.4 數據統計分析：用GeneMapper4.0軟件分析STR掃描結果，讀取等位基因片段大小，通過PopGen 1.32軟件計算觀測等位基因數、有效等位基因數[14]、觀測雜合度、期望雜合度、F-統計量、Shannon信息指數、Nei遺傳相似度及遺傳距離[15,16]等指標。在線軟件GenePop對各位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及雜合子缺失檢驗。PIC_CALC軟件對每個位點進行多態信息含量(PIC)分析。

2 結果與分析

2.1 各微衛星位點在總群體上的遺傳分布

統計25個微衛星位點在兩個豚鼠群體各個體的基因型，計算各位點的觀察等位基因數、有效等位基因數、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數、多態信息含量、F-統計量，結果見表2。25個微衛星位點在兩個群體中共發現121個等位基因，每個位點2～10個，平均4.84個。有效等位基因數在1.0812～7.0865之間，平均為3.148；觀察雜合度在0.0781～0.8281之間，平均為0.4726；期望雜合度在0.0757～0.8656之間，平均為0.6070；Shannon信息指數在0.165～2.0572之間，平均為1.1702；多態信息含量(PIC)在0.072～0.843之間，平均為0.552。

表1 25個豚鼠微衛星位點的相關信息

表2 25個微衛星位點在總群體上的遺傳分布

2.2 兩群體遺傳多樣性比較

如表3所示，A群和B群分別檢測到103和116個等位基因；平均觀察雜合度分別為0.4467和0.5062；平均期望雜合度分別為0.5195和0.5838；平均多態信息含量分別為0.459和0.518。可以看出，B群的豚鼠群體遺傳多樣性稍大于A群。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

本研究采用馬可夫鏈法[17]計算兩個群體每個位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的精確P值[P(HWE)]、雜合子缺陷P值[P(ht.def)]與雜合子過多的P值[P(ht.exc)]，并計算相應的Fis (W&C)和Fis (R&H),結果見表4。A種群有5個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡[P(HWE)<0.05 ],偏離平衡的這5個位點中有4個表現出雜合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]；B種群有6個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡[P(HWE)<0.05 ],偏離平衡的這6個位點中有5個表現出雜合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]。

2.4 群體間遺傳關系

遺傳分化系數(Fst)和遺傳距離結果見表2。兩個群體25個位點的Fst范圍從0.0043到0.4656，平均為0.1056。兩群體的Nei’s(1972) 遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204。

表3 兩個封閉群豚鼠的遺傳多樣性

Nei: Nei's (1973) expected heterozygosity

表4 兩群體的Hardy-Weinberg平衡及雜合子缺失和過多檢驗

3 討論

3.1 兩個封閉群豚鼠遺傳多樣性

有效等位基因數是基因純合度的倒數，反映了等位基因的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個指標[18]。雜合度或群體平衡狀態是群體遺傳結構分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度值應介于0.5～0.7。多態信息含量是表示微衛星座位多態性高低的一個指標。當微衛星座位PIC>0.5時，表明該遺傳標記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態性座位；當0.25

根據Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果，A種群豚鼠在5個位點顯著偏離遺傳平衡，B種群豚鼠在6個位點顯著偏離遺傳平衡，并且兩個種群偏離平衡的位點，大多表現為雜合子缺陷。導致這一現象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是在飼養繁殖過程中未能實現隨機交配，近交程度有所升高導致的。實驗動物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現象似乎是其繁殖過程中經常出現的一個問題[19，20]。目前由于封閉群動物普遍缺乏相應的遺傳監測，因此在繁育過程中要遵守嚴格的操作程序以避免近交現象，同時，通過定期的遺傳檢測對其生產管理及繁殖方式等作出評估及調整是必需的。

3.2 兩個封閉群豚鼠遺傳關系

Fst是種群之間遺傳差異的一種測度。F-統計量計算結果表明，兩個種群在25個微衛星位點的平均Fst為0.1056，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的10.56%，89.44%的遺傳變異來自群體內部的遺傳多樣性。依據遺傳分化指數Fst的解釋(介于0-0.05之間說明種群間分化很弱,0.05-0.15之間表示中等分化,0.15～0.25之間表示分化大,大于0.25表明分化極大)[21],說明兩群體間的遺傳分化已達到中等水平。

遺傳距離以兩個群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數來測定,被用以描述群體的遺傳結構和品種間的差異。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204，說明兩群體間的親緣關系較近。

本研究利用25個微衛星標記對兩個種群封閉群豚鼠的遺傳檢測表明，兩個種群均符合封閉群動物的群體遺傳特征，遺傳分化處于中等水平，B種群的多樣性略高于A種群。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果提示種群的繁殖過程中有不同程度的近交現象存在。本研究結果可為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標準的建立提供基礎資料。

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