貓皰疹病毒Ⅰ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用

王 吉，衛(wèi) 禮，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏薇，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

貓皰疹病毒I型(feline herpesvirus 1，F(xiàn)HV-1)又叫貓鼻氣管炎病毒(feline rhinotracheitis virus),屬皰疹病毒科，是有囊膜的雙鏈DNA病毒。病毒直徑約為128 nm～168 nm，能在貓胚腎、肺以及睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)良好增值和傳代。該病毒能致發(fā)貓鼻氣管炎病，貓是本病唯一的自然宿主，病貓是主要傳染源，通過(guò)直接接觸傳播[1-2]。主要侵害仔貓，感染貓癥狀嚴(yán)重時(shí)，出現(xiàn)體溫升高，明顯的上呼吸道感染[1-4].貓鼻氣管炎發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)50%。病毒在病貓的鼻、咽喉、氣管和支氣管以及舌、結(jié)膜等的部位增殖。該病最早從美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后在拿大、英國(guó)、荷蘭、瑞士、匈牙利、越南等地發(fā)現(xiàn)和流行，我國(guó)已多次發(fā)現(xiàn)可疑病例，并分離到病毒[3-6]。

貓作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在某些試驗(yàn)中，如降壓實(shí)驗(yàn)、作為弱視動(dòng)物模型及高眼壓動(dòng)物模型等具有不可替代的作用[7-9]，目前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)中，均沒(méi)有對(duì)實(shí)驗(yàn)用貓的檢測(cè)要求及相關(guān)規(guī)定[10]。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立特異、敏感、快速、定量準(zhǔn)確的FHV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，通過(guò)分子生物學(xué)手段，開(kāi)展對(duì)貓攜帶FHV-1核酸的檢測(cè)。對(duì)今后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)用貓的檢測(cè)工作及實(shí)驗(yàn)貓標(biāo)準(zhǔn)化研究具有積極的促進(jìn)作用，同時(shí)通過(guò)對(duì)貓皰疹病毒攜帶情況的檢測(cè)，為貓質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

貓皰疹病毒I型(FHV-1)、貓細(xì)小病毒 (又稱貓泛白細(xì)胞減少癥)(feline panleukopenia virus, FPV)：購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，編號(hào)分別為(VR-636、VR-652)；單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV-1)、犬皰疹病毒(canine herpesvirus ,CHV)、豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)：由中國(guó)食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室提供；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；33只貓的48份樣品(眼分泌物、鼻分泌物、眼和鼻分泌物)來(lái)源于國(guó)內(nèi)7個(gè)單位。

1.2 主要試劑

DNA快速提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10× PCR buffer、100 bp DNA marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；10× Q-PCR MIX：美國(guó)ABI公司。PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司MyCycler；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國(guó) Kodak公司 GL212Pro；熒光定量PCR儀：美國(guó)ABI公司7500 Fast Real-Time PCR System.。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品的制備

設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增TK基因保守區(qū)域的引物：P-1F：ATACTGTCCGCATTTACATAGA；P-1R：CGGTTCTTGAGCGTCCC。擴(kuò)增片段長(zhǎng)531 bp (66442～66972 nt)。該片段包含了探針及其引物所要擴(kuò)增和檢測(cè)的片段。將該產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T Easy載體，并進(jìn)行克隆。陽(yáng)性克隆通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)陽(yáng)性克隆菌并提取質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀測(cè)定A260nm和A280nm，并計(jì)算提取的質(zhì)粒含量，質(zhì)粒置-20℃保存?zhèn)溆肹11,12]。

1.4 TaqMan探針及引物的設(shè)計(jì)

將不同株FHV-1病毒序列進(jìn)行比對(duì)，選擇TK基因(序列號(hào)：FJ478159)保守區(qū)域[6、11]，采用ABI PrimerExpress 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM(5’端)作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán), NFQ(3’端)為淬滅基團(tuán)，探針和引物由美國(guó)ABI公司合成。序列如下(表1)：

表1 用于擴(kuò)增TK基因的引物與TaqMan探針序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)優(yōu)化在熒光定量PCR反應(yīng)體系中使用的探針、引物、10× Q-PCR MIX濃度，確定最佳反應(yīng)體系為10× Q-PCR MIX 10 μL，探針+引物1 μL， DNA 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。確定最佳反應(yīng)條件為：50℃保持2 min；然后95℃預(yù)變性10 min；最后95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。在96孔板中按以下體系加樣，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。

用含有目的片段的質(zhì)粒pGEM-T Easy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)，算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。將其稀釋為109copies～100copies，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[12,13]。

Query:測(cè)序結(jié)果；sbjct:FHV-1文獻(xiàn)序列

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè)

設(shè)定FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK陰性對(duì)照，檢測(cè)FHV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL 3個(gè)不同濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，分3個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏性檢測(cè)

取109～100copies標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品各做3個(gè)復(fù)孔。所能檢測(cè)的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≥35,拷貝數(shù)(copies)≥10時(shí),此濃度為方法的檢測(cè)靈敏度。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，48份樣品分2次檢測(cè)，第1次檢測(cè)b1～b15，第2次檢測(cè)y1～y15、yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63。每次設(shè)107～103copies標(biāo)準(zhǔn)品和CRFK細(xì)胞陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照及樣品均做3個(gè)重復(fù)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定：建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope在-3～-3.5之間、R2大于0.99、Eff%在90%-110%之間，實(shí)驗(yàn)成立可用于定量檢測(cè)。

樣品循環(huán)閾值(CT)≥35,同時(shí)拷貝數(shù)(copies)≥10,判定該樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；循環(huán)閾值(CT)≥35、拷貝數(shù)(copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)<10，此樣品超出檢測(cè)限，不能確定被檢樣品是陽(yáng)性樣品，結(jié)果判為陰性[12,13]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品的制備

陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序進(jìn)行鑒定，測(cè)序結(jié)果與GenBank中FHV-1標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性均為100%，見(jiàn)圖1。說(shuō)明成功制備了陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可作為熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。

經(jīng)拷貝數(shù)計(jì)算公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)計(jì)算，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原濃度為2.55× 1011copies/μL。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)引物及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化后，得到FHV-1擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖2。FHV-1的循環(huán)閾值CT值為14.023，拷貝數(shù)為2.597×107copies/μL。

用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102copies/μL，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線如圖3。擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍1個(gè)log(1×102～1×109拷貝)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope為3.23(在-3～-3.5之間)，R2值為0.997(>0.99)說(shuō)明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，擴(kuò)增效率Eff為103.418%(90%～110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差(CTSD值)均小于0.232，說(shuō)明定量結(jié)果精密度高，具有很好的重復(fù)性。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)遠(yuǎn)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍，可用于定量檢測(cè)。

圖2 FHV-1Q-PCR擴(kuò)增曲線

圖3 109～102 copies標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性檢測(cè)：分別以FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK細(xì)胞為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，可以看出以FPV、HSV-1、CHV、PRV為模板，擴(kuò)增曲線均為直線無(wú)擴(kuò)增，陰性對(duì)照CRFK細(xì)胞也為直線無(wú)擴(kuò)增，而以FHV-1為模板擴(kuò)增曲線明顯。說(shuō)明建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果：起始濃度分別為1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)測(cè)值的均值分別為0.991×103、1.060×104、1.005×105copies/μL，對(duì)應(yīng)CTSD值及CV值分別為見(jiàn)表2。3個(gè)濃度梯度3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

1：FHV-1；2-6： FPV、HSV-1、CHV、PRV、CRFK

圖5 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

表2熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2The results of repeatability and stability test of the Q-PCR

標(biāo)準(zhǔn)品(copies/μL)standard(copies/μL)實(shí)驗(yàn)次數(shù)The number of experiment每次檢測(cè)CT均值Mean CT value of every time detection 3次檢測(cè)CT均值Mean CT value of three times detection標(biāo)準(zhǔn)差CTSD變異系數(shù)CV (%)Coefficient of variation (%)118.694105217.26418.0520.7264.0318.197122.354104221.72622.2910.5362.4322.793125.957103225.02125.8760.8173.2326.649

圖6 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)

如圖5、圖6可知，擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍 (1×100～1×109copies/μL)，良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率Slope為-3.156、相關(guān)系數(shù)R2值為0.993(>0.99)，擴(kuò)增效率Eff%為107.052%(90%-110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.0×101copies/μL時(shí)有明顯擴(kuò)增曲線，CT值為31.856，拷貝數(shù)為10.23 copies，仍在可信范圍之內(nèi)； 1.0×100copies/μL時(shí)有擴(kuò)增曲線，CT值為34.705，拷貝數(shù)為1.121 copies，已超出可信范圍。所以臨界稀釋度為1.0×101時(shí)，其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為10，因此最低檢測(cè)限度為10個(gè)拷貝/μL。說(shuō)明建立的熒光定量PCR方法有很高的靈敏度。

圖7 1～15號(hào)貓鼻分泌物(b1～b15)擴(kuò)增曲線

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的應(yīng)用

將所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于33只貓的48份樣品檢測(cè)，得到擴(kuò)增曲線如圖3-7為b1～b15擴(kuò)增曲線；圖8為y1～y15擴(kuò)增曲線；圖9為yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63擴(kuò)增曲線。2次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線分別為 圖10、圖11，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope分別為3.19、3.27(均在-3～-3.5之間)，R2值分別為0.996、0.994(均>0.99)，擴(kuò)增效率Eff分別為105.127%、101.639(均在90%-110%之間)。

經(jīng)過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)b3、b4、b5、b6、b7、b8、b11～b15，y4、y5、y6、y7、y11～y15，yb56、yb64、yb65、x16、x19、x24、x28、x38、x41、x47、x56、x57、x63的循環(huán)域值(Ct值均≥35)和拷貝數(shù)(copies均≥10)均在檢測(cè)限之內(nèi)，所以判定上述樣品為熒光定量檢測(cè)陽(yáng)性。其他15份樣品或循環(huán)域值(CT)超出檢測(cè)限，或擴(kuò)增拷貝數(shù)小于檢測(cè)限，或同時(shí)在檢測(cè)限之外，所以均判為陰性(樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3)。48份樣品檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為(33/48)68.75%，33只貓經(jīng)檢測(cè)FHV-1陽(yáng)性率為(23/33)69.70%。

圖8 1～15號(hào)貓眼分泌物(y1～y15)擴(kuò)增曲線

圖9 3只貓眼鼻分泌物和15份血清擴(kuò)增曲線

圖10 第一次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖11 第二次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

3 討論

貓可較好的耐受麻醉和一般手術(shù)，手術(shù)時(shí)能保持正常血壓。在藥品的降壓物質(zhì)檢查中，貓作為中國(guó)藥典規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[10，15]，越來(lái)越多的被用于形覺(jué)波剝奪性弱視、食管病等研究[16，17]。貓作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雖然應(yīng)用越來(lái)越廣泛[18-20]，但國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)有開(kāi)展貓的檢測(cè)。雖然早在1999年，蔣虹等[21]就建立過(guò)貓鼻氣管炎病毒血清學(xué)檢測(cè)方法，2011年前劉寶山、林穎、屈哲[22-24]先后建立了FHV-1 PCR檢測(cè)方法，但都沒(méi)有推廣開(kāi)來(lái)，實(shí)驗(yàn)用貓到目前為止也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定。目前，實(shí)驗(yàn)用貓也多是從商販或收購(gòu)型飼養(yǎng)場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，其來(lái)源混雜，遺傳、年齡、微生物和寄生蟲(chóng)等攜帶情況不清，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性差，結(jié)果隱存著未知因素的影響[15]。FHV-1是目前已知最重要的貓呼吸道疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高,嚴(yán)重危害貓的健康。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有開(kāi)展貓皰疹病毒等貓易感病毒臨床檢測(cè)的機(jī)構(gòu)，仍未見(jiàn)有開(kāi)展實(shí)驗(yàn)用貓F(tuán)HV-1檢測(cè)的報(bào)道，國(guó)內(nèi)也沒(méi)有相關(guān)檢測(cè)試劑盒的出售。

近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用[12-14]。該方法提供了用于對(duì)FHV-1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針，以實(shí)現(xiàn)貓F(tuán)HV-1核酸的定量檢測(cè)，提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。

表3 熒光定量PCR方法檢測(cè)48份樣品結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍8個(gè)log(102～109拷貝)定量范圍寬，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值均為>0.99，說(shuō)明相關(guān)性高定量結(jié)果準(zhǔn)確。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)(Slope均在-3～-3.5之間、R2均大于099、Eff%均在90%～110%之間)均在規(guī)定范圍之內(nèi)，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)特異性檢測(cè)與貓細(xì)小病毒、單純皰疹病毒1型、犬皰疹病毒及豬偽狂犬病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，證明方法特異性良好。經(jīng)靈敏度檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到101時(shí)仍有擴(kuò)增曲線，最低可檢測(cè)到10拷貝/μL。對(duì)起始濃度分別為1×103、1×104、1×105拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定， CT值變異系數(shù)均小于5%。說(shuō)明此方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[12-14]。

用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)FHV-1,目前在國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道。本研究對(duì)引物和探針的濃度及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了特異、敏感的FHV-1快速定量檢測(cè)方法。對(duì)貓的檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)的33只貓，陽(yáng)性率為69.70%(23/33)，明顯高于本室建立的常規(guī)PCR(陽(yáng)性率63.64(21/33))檢出率。但從檢測(cè)成本考慮，熒光定量PCR檢測(cè)成本稍高于常規(guī)PCR。實(shí)驗(yàn)建立的FHV-1熒光定量PCR方法為進(jìn)一步研究FHV-1在貓群中的流行情況及對(duì)貓的感染機(jī)制及其致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。為實(shí)驗(yàn)用貓的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)參考依據(jù)。

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