Walker256脛骨癌痛模型大鼠的脾臟T淋巴細胞功能評價

杜俊英，梁 宜，陳宜恬，吳賽飛，王 虎，房軍帆，方劍喬

(浙江中醫藥大學第三臨床醫學院針灸神經生物學實驗室，杭州 310053)

機體的免疫功能與腫瘤的發生發展有密切關系，已有研究認為人體免疫功能低下或被抑制時，腫瘤發病率增高，而在腫瘤進行性生長中，腫瘤患者的免疫功能受抑制，兩者互為因果，雙方各因素的消長對腫瘤的發展起著重要的作用[1]。Walker-256脛骨癌痛模型是一種國內外比較公認的研究癌癥鎮痛藥物的實驗模型[2]。有關此模型的免疫功能變化目前未見有報道，本文觀察Walker256脛骨癌痛大鼠模型，觀察其T淋巴細胞增殖功能、T淋巴細胞及其亞群占脾臟淋巴細胞的含量變化，致力于明確Walker256腫瘤細胞是否適合免疫調節藥物抗腫瘤作用的研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

選用清潔級雌性健康SD大鼠41只(實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016)，體重(160±20)g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料(由實驗動物中心提供)，及自由飲水，12 h循環燈光，恒定濕度，室溫23℃±2℃。實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2013-0184。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2 儀器與試劑

RPMI 1640(11875-119，美國Gibco)；特級胎牛血清(30044184，美國Gibco)；Walker-256腫瘤細胞(3111C0001CCC000316，北京北納創聯生物技術研究院)；青霉素-鏈霉素溶液(100X)(C0222，碧云天生物技術研究所)；青霉素(國藥準字H36020261，江西東風藥業股份有限公司)；CCK-8試劑盒(C0038，碧云天生物技術研究所)；流式細胞術所用試劑均采購自美國eBioscience公司；鹽酸嗎啡注射液(C81004-2，東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠)，其余試劑均為市售分析純級。動態足底測量儀(意大利UgoBasile)、足底熱輻射儀(意大利UgoBasile)、全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)、BD FACS Canto ll流式細胞儀(美國BD公司)、洗板機(美國Bio-Rad公司、韓氏穴位暨神經刺激儀(北京華衛產業開發公司)。

1.3 骨癌痛模型制備

脛骨癌痛大鼠模型制備參造Medhurst等[3]的實驗方法，大鼠10%水合氯醛(0.35 mL/100g)腹腔麻醉，仰臥位，左后肢備皮、皮膚消毒，脛骨上段切1 cm口，暴露脛骨頭，9號針頭于脛骨結節下外5 mm處與脛骨呈30℃～45℃角朝尾側進針鉆洞，微量注射器抽取Walker-256腫瘤細胞懸液10 μL(1×107cells/mL)注入脛骨骨髓腔，保持2 min拔出針頭，無菌骨蠟快速封閉針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，肌內注射20萬單位青霉素防感染。

1.4 分組與處理

本次實驗分兩批進行，第一批實驗大鼠(共16只)完全隨機分為PBS組和模型組，用于觀察實驗動物造模前(基礎)、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d十個時間點的機械縮腿閾、熱輻射刺激潛伏期和自發性疼痛的變化情況。第二批實驗大鼠(共25只)完全隨機分為空白對照組、PBS組和模型組，用于觀察造模后20 d大鼠脾臟細胞T淋巴細胞增殖功能，T淋巴細胞及其亞群占脾臟淋巴細胞的含量。

1.5 指標檢測

1.5.1 行為學觀察：我們動態觀察了各組大鼠造模前(基礎)、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d十個時間點機械縮腿閾、熱輻射刺激潛伏期和自發性疼痛。

1.5.1.1 機械縮腿閾：測量前，將實驗大鼠置于塑料盒內，待大鼠安靜后(停止梳理毛發和探索性活動)，將類似Von Frey絲的金屬絲(φ0.5mm)置于大鼠患側足中央，避開足墊，啟動“START”按鈕，金屬絲即自動上抬，刺激力量以2.5 g/sec的速率遞增(Ramp=20 sec)，直至大鼠縮腿，儀器自動記錄當時的刺激力量。連續測量4次，取其平均值，每次間隔3 min。50 g為最大刺激力量，以免大鼠足爪受損。

1.5.1.2 熱輻射刺激潛伏期：操作方法與測量機械縮腿閾相似。測量前，將大鼠置于透明塑料盒中。待大鼠安靜后(停止梳理毛發和探索性活動)，將聚焦的紅外熱源置于大鼠患側足中央，避開足墊，啟動“START”按鈕對足底進行熱刺激，儀器自動記錄大鼠縮足反應時的潛伏期。連續測量3次，每次間隔5 min。20 s是熱輻射刺激時間最上限，30 s為最大熱輻射強度。

1.5.1.3 自發性疼痛評價：根據大鼠自由活動時后肢使用以及跛行程度，分別給予0-3級評分。0分：正常行走；1分：后肢跛行，但不是很顯著，使用正常；2分：介于1和2分之間；3分：后肢行走時不著地。

1.5.2 生化指標：

1.5.2.1 脾臟淋巴細胞提取：造模后20 d，各組實驗大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/100g)，75%酒精擦拭腹部皮膚，取出脾臟，稱重后置于抗生素生理鹽水(青霉素G 10000 U/mL、鏈霉素10000 μg/mL)中浸泡20 min，將脾臟置于200目不銹鋼網篩上，剪碎脾臟后進行研磨，期間加PBS(滅菌)濕潤。獲得的細胞懸液加入3～5倍細胞體積的紅細胞裂解液(碧云天)，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min，1 000 r/min離心5 min，去上清液。獲得的細胞懸液加5倍體積RPMI 1640(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U /mL霉素)，輕輕混合，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復兩次。清洗后的細胞加RPMI 1640(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U /mL鏈霉素)完全培養基重懸，調整濃度為1×106/mL的細胞懸液待用。

1.5.2.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測大鼠脾臟T淋巴細胞的增值能力:取96孔細胞培養板，四周加200 μL PBS(滅菌)以防液體揮發，各孔加入180 μL細胞懸液(大約2×105個)，并給予20 μL ConA刺激(終濃度10 μg/mL)作為反應孔，以相同體積不加ConA刺激的細胞懸液為空白孔，以200 μL細胞培養液為control，分別做3個復孔，細胞培養箱內培養72 h。各孔加入20 μL 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)溶液，在細胞培養箱內孵育1 h，用全波長酶標儀在450 nm、650nm波長下檢測其A值。細胞活性%=反應孔 A值/空白孔A值*100。

1.5.2.3 流式細胞術檢測大鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+的含量:收集、洗滌細胞調整細胞懸液濃度為1～5×106cell/mL，取100 μL細胞加入標記的一抗(1 μL CD3 FITC，1.25 μL CD4 APC，0.625 μL CD8 PE)，4℃孵育30 min(避光)。加100 μL 1%多聚甲醛，4℃孵育15 min(避光)。1 mL冰冷PBS重懸細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，重復3次。加500 μL冰冷PBS重懸細胞，進行流式檢測。control管：細胞+同等劑量PBS，不加一抗，其余步驟相同。同型對照管：細胞+熒光標記的同型IgG，其余步驟相同。單陽對照管：細胞+一種熒光標記的抗體，其余步驟相同。BD FACS Canto ll流式細胞儀檢測和分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 骨癌痛大鼠機械縮腿閾變化情況

我們采用足底動態測量儀檢測各組大鼠患側足跖造模前(基礎)、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d的機械縮腿閾。從表1中可以看到，造模前，PBS組和模型組大鼠基礎機械縮腿閾比較差異無顯著(P>0.05)。造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d各時間點，模型組大鼠機械縮腿閾明顯小于PBS組大鼠(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠機械縮腿閾變化情況

表2 各組大鼠熱輻射刺激潛伏期變化情況

表3 各組大鼠自發性疼痛變化情況

表4 各組大鼠脾臟T淋巴細胞及其亞群含量變化情況

2.2 骨癌痛大鼠熱輻射刺激潛伏期變化情況

我們還采用熱輻射法檢測了各組大鼠患側足跖造模前(基礎)，造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d的熱輻射刺激潛伏期，結果如表2 所示。造模前，PBS組和模型組大鼠的基礎熱輻射刺激潛伏期比較差異無顯著意義(P>0.05)。造模后4 d和6 d，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期有一定的下降，但與PBS組大鼠比較無統計學意義(P>0.05)。至造模后8 d和10 d，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期明顯小于PBS組大鼠(P<0.05)。到造模后12 d至整個實驗結束(造模后20 d)，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期和PBS組比較均差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 骨癌痛大鼠自發性疼痛變化情況

另外，我們還觀察了造模前(基礎)、造模后4、6、8、10、12、14、16、18 d和20 d十個時間點，各組大鼠患側足跖自發性疼痛的變化。如表3所示，造模前，PBS組和模型組大鼠患側足跖無自發性疼痛。造模后4 d至14 d，PBS組和模型組大鼠患側足跖出現自發性疼痛，模型組大鼠的自發性疼痛明顯高于PBS組(P<0.01)。造模后16 d，PBS組大鼠患側足跖已恢復正常，無自發性疼痛行為；模型組大鼠患側足跖仍具有自發性疼痛，明顯高于PBS組大鼠(P<0.01)。

2.4 骨癌痛大鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力變化情況

模型組大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖能力(104.03±7.47)明顯低于空白對照組(124.87±10.74)和PBS組(125.57±7.07)大鼠(P<0.05)。

2.5 骨癌痛大鼠脾臟T淋巴細胞及其亞群含量變化情況

注：圖A-I分別是空白對組CD3含量、PBS組CD3含量、模型組CD3含量、空白對組CD4含量、PBS組CD4含量、模型組CD4含量、空白對組CD8含量、PBS組CD8含量、模型組CD8含量

如表4,圖1所示，模型組大鼠脾臟T淋巴細胞(CD3)、及其亞群(CD4和CD8)的含量均少于空白對照組和PBS組大鼠，但僅CD8的含量明顯少于空白對照組大鼠(P<0.05)。

3 討論

本實驗所采用的脛骨內注射Walker-256腫瘤細胞建立的脛骨癌痛模型是國內外的用于研究骨癌痛機制的常見模型之一[4, 5]。Mao-Ying等[4]比較兩種濃度(4×105和4×103)的Walker-256腫瘤細胞脛骨內注射制備的骨癌痛中觀察到，不同濃度的Walker-256腫瘤細胞脛骨內注射均能導致模型大鼠雙側足跖機械痛覺異常和自發性疼痛的產生，但未觀察到明顯的熱痛覺異常；同時4×105組比4×103組先出現機械痛覺異常，于造模后4 d即觀察到雙側機械痛閾明顯下降。我們的結果與Mao-Yin相似，造模后4 d，模型組大鼠患側機械痛閾明顯下降、出現顯著的自發疼痛現象；并且在整個實驗的各個時間點，模型組大鼠的機械痛閾和自發性疼痛評分均顯著低于空白對照組和PBS組。有關熱痛覺異常方面，我們的結果與Mao-Yin不一致，我們觀察到，模型組在造模后8、10、12 d這三個時間點時，其熱輻射刺激潛伏期明顯低于空白對照組和PBS組；其他各個時間點的熱輻射刺激潛伏期與空白對照組和PBS組比較無顯著差異。另有學者[5]采用脛骨內注射4×104個Walker-256腫瘤細胞觀察期熱痛閾變化情況中發現，骨癌痛模型的熱痛閾于造模后12 d顯著下降，并且在于造模后15 d、18 d和21 d時模型組的熱痛閾均顯著小于PBS組。

T淋巴細胞簡稱T細胞，來源于骨髓中的淋巴樣前祖細胞，在胸腺中發育成熟。成熟的T細胞只能表達CD4或CD8分子，即CD4+T細胞或CD8+T細胞。CD4和CD8分子的主要功能是輔助TCR識別抗原和參與T細胞活化信號的轉導。CD4+T細胞和CD8+T細胞的功能彼此不同。CD4+T細胞細胞識別由13～17個殘基組成的外源性抗原肽，受自身MHC II類分子的限制。活化后，分化的效應細胞主要為Th細胞，但也有少數CD4+效應T細胞具有細胞毒作用和免疫抑制作用。而CD8+T細胞識別8～10個殘基組成的內源性抗原肽，受自身MHC I類分子的限制。活化后，分化的效應細胞為Tc(CTL)細胞，具有細胞毒作用，可特異性殺傷靶細胞。盡管仍有爭議，但是越來越多的研究表明免疫系統能夠識別和消除初期腫瘤， CD4+T細胞和CD8+T細胞是重要的免疫監視介質[6]。由于腫瘤細胞較少表達NHC II類分子，傳統認為CD8+T細胞被認為是抗腫瘤免疫的主要T細胞，而CD4+T細胞在腫瘤免疫中的主要作用為輔助CD8+T細胞的活化[7-9]。但是，也有文獻報道，CD4+T細胞可直接對腫瘤產生細胞毒作用[10, 11]，且在無CD8+T細胞參與的情況下，CD4+T細胞也具有抑制腫瘤的作用的能力[12]。在CD4+T細胞缺失的情況下，CD8+細胞的抗腫瘤作用受限制[13, 14]。亦有研究報道，MHC I類限制性轉基因小鼠，CD4+T細胞缺失的情況下，CD8+T細胞仍能保持抗腫瘤作用[15]。

我們本次的實驗中，觀察到Walker-256腫瘤細胞可以降低外周脾臟T淋巴細胞的增殖能力，減少T淋巴細胞及其亞群的含量，尤以CD8+T淋巴細胞含量的減少為甚。CD8+T細胞作為抗腫瘤的主要細胞之一，所以我們認為，Walker-256致骨癌痛模型可以抗腫瘤免疫藥物研究的模型之一。

參考文獻：

[1] 文亞平, 高麗華, 黎明.腫瘤與免疫系統的相互作用及腫瘤免疫治療新策略[J]. 中國腫瘤, 2011, 2:103-107.

[2] 李曉青, 孫玉明, 黃章翔,等. Walker256乳腺癌細胞構建大鼠脛骨骨癌痛模型[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2008, 15: 41-45.

[3] Medhurst S, Walker K, Bowes M, et al. A rat model of bone cancer pain[J]. Pain, 2002, 96:129-140.

[4] Mao-Ying QL, Zhao J,Dong ZQ, et al.A rat model of bone cancer pain induced by intra-tibia inoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345:1292-1298.

[5] 嚴繼貴, 童曄玲,何國濃, 等.應用 walker-256 細胞建立大鼠骨癌痛模型[J]. 中華中醫藥學刊, 2007, 25:1128-1130.

[6] Koebel CM, Vermi W, Swann JB, et al. Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state[J]. Nature, 2007, 450:903-907.

[7] Antony PA, Piccirillo CA, Akpinarli A, et al. CD8+T cell immunity against a tumor/self-antigen is augmented by CD4+T helper cells and hindered by naturally occurring T regulatory cells[J].J Immunol, 2005, 174:2591-2601.

[8] Fujii H, Arakawa A, Utsumi D, et al. CD8(+) tumor-infiltrating lymphocytes at primary sites as a possible prognostic factor of cutaneous angiosarcoma[J]. Int J Cancer, 2014, 134:2393-2402.

[9] Chen Y, Ayaru L, Mathew S, et al.Expansion of anti-mesothelin specific CD4+and CD8+T cell responses in patients with pancreatic carcinoma[J]. PLoS One, 2014, 9:e88133.

[10] Noyan F, Lieke T, Taubert R, et al. Naive tumor-specific CD4(+)T cells were efficiently primed in acute lymphoblastic leukemia[J]. Scand J Immunol, 2014, 80: 161-168.

[11] Snook AE, Magee MS, Schulz S, et al. Selective antigen-specific CD4(+)T-cell, but not CD8(+) T- or B-cell, tolerance corrupts cancer immunotherapy[J]. Eur J Immunol, 2014, 44:1956-1966.

[12] Segal BM, Glass DD, Shevach EM. Cutting edge: Il-10-producing CD4+T cells mediate tumor rejection[J]. J Immunol, 2002, 168:1-4.

[13] Haabeth OA, Tveita AA, Fauskanger M, et al. How do CD4(+) T cells detect and eliminate tumor cells that either lack or express MHC class Ⅱmolecules?[J]. Front Immunol, 2014, 5:174.

[14] Boon T, Coulie PG, Van den Eynde BJ, et al. Human T cell responses against melanoma[J]. Annu Rev Immunol, 2006, 24:175-208.

[15] Hanson HL, Donermeyer DL, Ikeda H, et al. Eradication of established tumors by CD8+T cell adoptive immunotherapy[J]. Immunity, 2000, 13:265-276.