卵巢組織玻璃化冷凍的研究進展

王勁松，左 琴，范 濤，李保文

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

隨著我國生命科學的快速發展，體外受精、核移植、轉基因動物制作等胚胎工程技術對卵源的需求量大幅增加，卵巢組織的凍存技術使卵母細胞的收集保存得以實現，并且卵巢組織的凍存不受年齡、生殖周期的影響，甚至可以從死亡的動物獲得，是行之有效的保存卵母細胞的方法。近年來，新的基因打靶技術(如TALENs和CRISPR)日漸成熟，為基因工程動物的制作提供了便利，從而極大地豐富了疾病模型動物的資源，為生命科學基礎研究及新藥研發篩選提供了有力保障，但豐富的實驗動物種質資源也對保種方法提出新的要求；此外，一些疾病模型動物繁殖力低甚至無繁殖力的情況時有發生。卵巢冷凍保存可以通過復蘇后移植、體外受精 (IVF)或胞質內精子注射 (ICSI)技術得到后代，是繼胚胎冷凍、精子冷凍后，又一有效保存實驗動物種質資源的方法。

1 卵巢組織的程序化冷凍與玻璃化冷凍

卵巢組織的冷凍是利用低溫使細胞降溫、脫水，形成非損傷性結冰，其分子運動速度降低、停止，組織細胞處于休眠狀態，達到冷凍貯存的目的。目前常用的卵巢組織冷凍方法為程序化冷凍法和玻璃化冷凍法。程序化冷凍法是較為成熟的保存卵巢組織的方法，冷凍效果穩定，但該方法需程序降溫儀來控制降溫速度，儀器價格昂貴，過程復雜，樣本處理數量少，并不適合對實驗動物種質資源的保存；此外，在凍融過程中不可避免地在細胞內、外形成冰晶，損傷細胞及細胞間連接結構，相互擠壓、變形甚至破裂死亡，影響組織結構及活性。玻璃化冷凍是近十幾年新發展起來的冷凍保存技術，在快速降溫的過程中，與高濃度的冷凍保護劑混合的水分子沒有足夠時間排列成晶體結構，并可迅速通過冷凍敏感區，形成介于液體和固體之間的高黏度非晶體的“玻璃化狀態”，可使液體分子的凝固呈無序排列，維持溶液的水分子和離子分布，跨膜物質濃度和滲透壓差別較小，可以最大限度減少冰晶形成對細胞的機械性損傷[1]和凍融效應。Fahy等[2]將該過程描述為：“液體的黏度逐漸增加直到分子停止運動，從液態性質轉變為固態性質”。 Liebermann等[3]提出合適的冷凍速率會導致水分外流，形成細胞外的玻璃化現象。玻璃化冷凍技術簡單、高效，已經成功應用于胚胎和卵母細胞的冷凍保存。1985 年 Rall 首先應用玻璃化冷凍法成功凍融了小鼠胚胎，隨后該方法在胚胎、卵母細胞的凍存中開展了應用研究[4-6]，在20世紀90年代初期，學者對小鼠、大鼠、兔、猴、牛等的卵巢組織進行了玻璃化冷凍研究，取得一系列的成功。

2 影響卵巢玻璃化冷凍的因素

2.1 卵巢組織的前處理

卵巢組織過大或過厚會影響冷凍保護劑的滲透，而且移植后需要更長時間與受體動物形成血管重建、恢復組織供血，易造成移植初期的組織缺血損傷，影響卵泡發育，甚至導致組織壞死。液氮的沸點為 -196℃，在玻璃化冷凍過程中，卵巢組織塊會在浸入液氮時導致液氮的沸騰而產生氮氣，包圍卵巢組織，形成“蒸汽罩”，減緩熱傳遞，減緩組織降溫速率，引起細胞損傷，影響凍存效果。理論上，組織塊體積越小，其表面形成的“蒸汽罩”面積就越小，對凍存的效果的影響越小，但組織塊體積太小，會造成在切割處理時丟失較多卵泡，產生不能利用的組織塊。目前卵巢組織的處理大多為厚度約 1 mm，一般不超過 2 mm。有研究表明，在鼠類動物模型中，冷凍卵巢組織的一般大小為1 mm × 1 mm × 0.5 mm[7]。國內有學者將小鼠卵巢組織塊切成 1～3 mm3，均可較好地保存其原始卵泡和初級卵泡[8]。Gook等[9]認為，將卵巢組織切割成 2.0～5.0 mm大小對于凍存結果影響不大，但可以保護體積較大的腔前卵泡。有學者對不同形狀的卵巢組織塊冷凍復蘇后的效果做了比較研究，Scott等[10]冷凍不同形狀的人類卵巢組織，立方體形的組織塊較其他形狀的組織塊更早出現生長較好的存活卵泡。Ishijima等[11]將卵巢組織處理為不同大小的立方體，觀察發現，冷凍保護劑對125 mm3卵巢組織仍可起到保護作用。

2.2 冷凍保護劑的選擇

合適種類與濃度的冷凍保護劑對卵巢玻璃化冷凍至關重要。冷凍保護劑的種類分為滲透性和非滲透性兩種，常用的滲透性冷凍保護劑包括二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PROH)、甘油、乙酰胺和甲醇等可以滲透到細胞內的小分子類物質；非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是大分子物質，主要包括糖類、聚合物、血清及抗冷凍蛋白等。玻璃化冷凍保護劑的濃度較程序化冷凍保護劑高，高濃度的冷凍保護劑可以升高玻璃化溫度，在冷凍降溫過程中使細胞內外水分子形成高黏度的“玻璃態”。同時高濃度冷凍保護劑具有更高的細胞毒性作用，增加對細胞的損傷。將不同的冷凍保護劑組合使用，利于其協同作用，提高整體濃度，保證冷凍效果，亦利于控制各組分的濃度，有效降低細胞毒性。滲透性冷凍保護劑中，乙二醇毒性較低，是應用較廣泛的冷凍保護劑，但乙二醇在冷凍時形成“玻璃態”的能力較差。二甲基亞砜是較適合卵巢組織冷凍的保護劑，它分子量較小、滲透力強于乙二醇，但細胞毒性較大。有學者將二甲基亞砜與乙二醇、丙二醇混合使用，在卵巢的玻璃化冷凍保存研究中取得較好的效果[12-15]。蔗糖、海藻糖、棉子糖等糖類及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚蔗糖、葡聚糖等聚合物是較常用的非滲透性冷凍保護劑，一般與滲透性冷凍保護劑聯合使用，可以減少滲透性冷凍保護劑的用量[16]，降低其細胞毒性。同時大分子物質能夠提高冷凍液黏度，加快冷凍液玻璃化過程；并且能夠增加細胞外壓引起細胞脫水，防止冰晶的形成。此外，非滲透性冷凍保護劑還具有穩定細胞膜結構的作用。高分子聚合物作為非滲透性冷凍保護劑能夠在細胞表面形成黏性膜狀結構，在冷凍過程中阻斷冰晶形成，減輕冷凍及復溫對組織的損傷[17]。Hashimoto等[18]在卵巢的玻璃化冷凍保護劑中添加聚乙烯吡咯烷酮作為非滲透性冷凍保護劑，取得較好效果。Isachenko等[19]在將二甲基亞砜、乙酰胺、聚乙二醇及丙二醇聯合使用作為冷凍保護劑，具有較好的冷凍保存效果。動物血清和抗凍蛋白的添加對卵巢的玻璃化冷凍效果也有積極地影響。

2.3 滲透平衡方法

卵巢組織結構較復雜，細胞在組織內相互連接成團，其中包括卵泡、基質細胞、顆粒細胞、膜細胞等，冷凍保護劑對不同類型細胞的滲透作用存在差異，為使組織中不同類型的細胞達到相同的冷凍保護劑濃度，適宜的滲透平衡的時間尤為關鍵，要保證足夠的時間使冷凍保護劑充分滲透到細胞內，同時又要避免平衡時間過長增加冷凍保護劑的細胞毒性。此外，滲透平衡的時間也取決于冷凍保護劑的濃度及溫度。較高濃度的冷凍保護劑能更好的降低液體的冰點，避免冷凍時結成冰晶損傷組織，但過高的冷凍液濃度會導致細胞內外過高的滲透壓差，產生細胞損傷。加入滲透性保護劑后，可降低液體的冰點，并且隨濃度升高其降低冰點的能力也升高，因此提高液體中冷凍保護劑的濃度可大大降低液體的冰點。但同時面臨的另一問題是隨著胞內溶質濃度的升高其滲透壓也加大，導致細胞內外產生的較高的滲透壓差進而對細胞產生破壞作用。因此冷凍保護劑的濃度必須盡可能的高，使在胞內冰晶形成之前細胞能更充分地脫水，但同時又要調整溶質的滲透壓使其造成的有害影響較小。較高的溫度會增加冷凍保護劑的毒性，多數文獻報道的滲透平衡溫度在0℃～4℃，但也有學者認為在較高的溫度下冷凍保護劑可以更快速地滲透，需要更少的平衡時間，反而會降低冷凍保護劑毒性[20]。

在卵巢組織浸入冷凍保護劑的滲透平衡過程中，要綜合分析所用冷凍保護劑的種類、濃度確定平衡溫度及平衡時間，著重考慮其保護效果和細胞毒性，以減少冷凍過程對卵巢造成的損傷，保證凍存的效果。Newton等[21]的研究表明，以DMSO和EG用作冷凍保護劑，較適宜的平衡溫度為4°C，而PROH在37°C經過30 min的滲透平衡，其滲透效果優于DMSO和EG。Fabregues等[22]的研究也提出，在4°C時，相比PROH，DMSO和EG滲透進入卵巢組織的速度更快。陳薪等[23]采用乙二醇和蔗糖兩步法，預平衡 10 min，將卵巢組織直接投入液氮進行玻璃化冷凍，沒有造成細胞DNA的損傷。Gook[24]用1.5 mol/L的PROH及1.5 mol/L PROH + 0.1 mol/L蔗糖作為冷凍保護劑，室溫下兩步平衡，預平衡10 min，也取得較好的凍存效果。Moniruzzaman等[25]、Santos等[26]、Wang等[27]均使用兩步平衡法，取得成功。

2.4 冷凍載體

冷凍管作為目前普遍采用的卵巢玻璃化冷凍載體，投入液氮時會使液氮沸騰在管周圍產生蒸汽，形成“蒸汽罩”，而且冷凍管壁較厚，其材質熱傳導性也較差，影響降溫速率。理想的冷凍載體能保證卵巢組織塊的降溫速率，使其迅速通過冷凍溫度的危險區，同時又能降低卵巢細胞形成“玻璃態”所需要的細胞內液體濃度[28]，減輕冷凍保護液的細胞毒性。目前已有多種新的冷凍載體及操作方法被應用到卵巢組織的玻璃化冷凍上，如電鏡銅網(EMG)[29]、尼龍網(nylon mesh)、冷凍環(cryoloop)[30]、冷凍載桿(crytop)、封口式拉長麥管(CPS)、開口式拉長麥管(OPS)[31]、直接覆蓋玻璃化冷凍(direct cover vitrification，DCV)、固體表面玻璃化冷凍(solid surface vitrification，SSV)、針刺式載體浸入冷凍(needle immersed vitrification，NIV)等。中國臺灣學者Chen等[32]采用DCV法冷凍小鼠卵巢組織，凍存效果優于傳統的玻璃化冷凍方法：將經過滲透平衡的卵巢組織放入凍存管底部后直接浸入液氮，蓋上凍存管蓋，隨即放入液氮罐中保存，該方法降溫速率可達 15 000 ℃/min。Zhou等[14]用DCV法冷凍人類卵巢組織，冷凍效果與新鮮對照組相似。DCV法較傳統的玻璃化冷凍法大幅提高了冷凍時的降溫速率，但是卵巢組織與液氮直接觸，并沒有避免液氮沸騰形成的“蒸汽罩”，對冷凍速率仍然有影響。Dinnyes等[33]建立了SSV法，將經過冷凍液滲透平衡后的卵巢組織放在預先浸入液氮的金屬表面上，有效減少“蒸汽罩”的產生，提高了凍存效果。Santos等[26]、 Carvalho等[34]的研究也報道了相似的結論。Wang 等[35]提出NIV方法，以針灸針作為冷凍載體穿刺卵巢組織，直接浸入液氮凍存，這種凍存方法能最大程度減少冷凍降溫過程中保護劑的用量，提高降溫速率，凍融后獲得較好的移植效果。亦有學者采用NIV法，使用更低濃度的冷凍保護劑獲得較好的冷凍效果[36]。

3 存在的問題

目前卵巢的玻璃化冷凍尚沒有標準的冷凍方法和冷凍液配置方案[37]，最佳的冷凍方法和冷凍液配置方案應對卵巢組織的前處理、冷凍保護液濃度及種類、冷凍平衡時間方法、冷凍載體的選擇等方面綜合考慮，盡可能減少細胞的物理損傷，降低細胞的化學毒性，保證凍存卵巢的組織活性，提高凍融后卵泡的存活率。近年來，各國學者不斷嘗試新的冷凍方法，其凍存效果取得了一定的進展。尤其開放載體的應用有很多報道，在獲得更快的降溫速率的同時，由于卵巢組織直接與液氮接觸，存在被微生物污染的風險，對卵巢組織的安全應用有一定的影響。

但隨著低溫生物學和生殖生物學的不斷發展，在新方法、新材料的方面的不斷探索嘗試，卵巢組織冷凍保存技術一定會日趨完善，為更安全、更高效地保存實驗動物種質資源，推動生命科學基礎研究及新藥研發的更快發展提供有力保障。

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