鈉通道阻滯劑對癲癇大鼠神經元超微結構的影響

高然 裴雪梅 張文武

鈉通道阻滯劑對癲癇大鼠神經元超微結構的影響

高然 裴雪梅 張文武

目的 研究鈉通道阻滯劑對癲癇大鼠神經元超微結構的影響。方法 以鈉通道阻滯劑拉莫三嗪為干預因素, 通過制作大鼠癲癇模型, 對比正常對照組、正常給藥組、癲癇模型組和癲癇治療組大鼠神經元超微結構改變。結果 癲癇模型組大鼠神經元胞核、胞質改變明顯, 癲癇治療組神經元線粒體腫脹減輕。結論 鈉通道阻滯劑對癲癇大鼠神經元超微結構有影響。

鈉通道阻滯劑;癲癇;拉莫三嗪;超微結構

癲癇(Epilepsy)患者的神經元超微結構發生變化, 大量神經元變性、線粒體損傷, 其周圍膠質細胞水腫、突觸增多,這些變化影響癲癇的治療及其預后。新型鈉離子通道阻滯劑拉莫三嗪因作用效果好、對神經功能損傷小, 已做為全身強直陣攣的一線藥物被臨床廣泛應用, 此類藥物研究多集中在電生理及免疫方面［1,2］, 對神經系統超微結構影響尚未有人報道。本研究以拉莫三嗪為干預因素, 通過制作大鼠癲癇模型, 對比正常對照組、正常給藥組、癲癇模型組和癲癇治療組大鼠, 研究該藥是否對神經元超微結構有影響, 以探討該藥對癲癇轉歸及預后。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1. 1 實驗動物分組 云南系健康成年雄性SD大鼠40只,體重(350±20)g (深圳寶安區醫院動物實驗室提供), 隨機分為4組, 每組各10只：①正常對照組(A組)：未給予任何干預措施。②正常給藥組(B組)：正常大鼠予拉莫三嗪灌胃。③癲癇模型組(C組)：以馬桑內脂為致癲劑造癲癇模型, 未用拉莫三嗪治療。④癲癇治療組(D組)：以馬桑內脂為致癲劑造癲癇模型, 用拉莫三嗪灌胃治療。

1.1. 2 藥品試劑、儀器 拉莫三嗪片(商品名 安閑 湖南三金制藥有限責任公司);JEM-1400透射電子顯微鏡(JEOL);熱膨脹式超薄切片機(Leica)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備及取材 每次造模均在上午9∶00～11∶00進行。取大鼠稱重后按10 μl/g劑量吸取致癲劑馬桑內脂, 微量注射器將馬桑內脂注入大鼠腦室內, 觀察其活動以Racine做標準：1級:動須、咀嚼;2級：節律性點頭;3級：一側前肢陣攣;4級：站立伴雙前肢陣攣;5級：4級+跌倒伴全身抽搐。達到3級或3級以上為制備成功標準。四組在相同條件(清潔、通風、恒溫、恒濕)下飼養14 d, 正常給藥組、癲癇治療組每天均在同一時間作灌胃(拉莫三嗪0.15 mg·kg-1·d-1)治療。

1.2.2 固定及取材 作灌注固定, 乙醚麻醉大鼠, 固定四肢,開胸找到心包膜剪開, 穿刺針從心尖部刺入主動脈時用止血鉗夾閉, 先輸生理鹽水并剪開右心耳觀察流出液體量和澄清度, 當流出液體變澄清, 肝臟變白時, 繼輸4%多聚甲醛, 先快后慢, 見大鼠出現肌抖動消失后繼續灌注30 min。破顱骨后完整的取出腦組織放入4%多聚甲醛中繼續浸泡固定, 浸泡固定時間為6 h溫度4℃。

1.2.3 透射電鏡 在進行切片之前先將包埋塊修整成所需形狀和大小, 制好切片刀和水槽。用Leica熱膨脹式超薄切片機切片, 厚度40 nm。將超薄切片放到銅網(已泡二甲苯去脂, 晾干并覆上1% Formar膜)上, 經醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后電鏡觀察。

2 結果

JEM-1400透射電鏡在20000倍下觀察：①正常對照組神經元線粒體基質均勻, 電子密度一致, 雙層膜和板狀嵴清晰, 可見較多的高爾基復合體、滑面內質網, 豐富的線粒體、尼氏體及神經原纖維。其周圍星形膠質細胞質較少, 胞質的基質較疏松, 著色均勻, 有疏松分布的核糖體和內質網, 線粒體數量多, 體積小。神經氈內有無髓神經纖維, 有髓神經纖維和大量的星形膠質細胞突起。②正常給藥組神經元與正常對照組幾乎無差別。③癲癇模型組神經元線粒體腫脹明顯,結構模糊, 嵴變形扭曲、斷裂消失, 伴線粒體內、外膜的崩解,且部分線粒體呈空泡變。主要表現為粗面內質網和高爾基復合體擴張, 線粒體腫脹明顯, 髓樣變性, 尼氏體溶解, 核膜斷裂及胞質水腫。星形膠質細胞胞體腫脹而增大, 細胞質電子密度明顯低而清亮, 細胞器未見明顯改變。神經氈內膠質細胞突起明顯, 因腫脹而增粗, 其終末部分變尖, 細胞外間隙縮小, 神經元的胞突及有髓神經纖維和無髓神經纖維改變不明顯。④癲癇治療組神經元線粒體腫脹仍較減輕, 嵴破裂,部分線粒體基質中出現邊界不清的絮狀物, 細胞電子密度增高, 星形膠質細胞胞質及突起腫脹較癲癇模型組減輕。

3 討論

電壓門控鈉通道(VGSCs)是內在的神經元和神經肌肉興奮性的關鍵因子, 阻滯鈉通道減少神經元動作電位產生可用于癲癇治療, 尤其像SCN1A突變癲癇。而像腦外傷、顱內感染、腦卒中及腦腫瘤等原因造成癲癇時, 大腦神經元結構出現改變線粒體腫脹、細胞器崩解、胞漿出空白區、軸突末梢變性等不同程度的損傷, 鈉通道阻滯劑是否有作用？癲癇發病的形態基礎如核膜不連續、大量腫大的線粒體、軸突的發芽等神經壞死凋亡的特征, 這些特征導致神經元合成和釋放GABA的功能降低神經遞質失衡、神經元苔蘚狀纖維發芽(MFS)建立出返回性興奮回路。本研究中用藥后的神經元超微結構發生改變可以與下列因素有關：①阻滯了Na+內流, 通過鈉鈣轉換蛋白使細胞內Ca2+相應減少。Ca2+可通過NMDA受體減少癇樣放電, 同時通過線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)減輕線粒體水腫, ATP合成增加。②阻滯了Na+內流增加膜穩定, 除可增加細胞閾電位水平外還可增加GABA釋放減少癲癇發作。可推斷鈉通道阻滯劑除了減少發病率外還可減輕神經系統損傷對該病的轉歸及預后良性影響。

［1］ Dibue M, Kamp MA, Alpdogan S, et al. Cav 2.3 (R-type) calcium channels are critical for mediating anticonvulsive and neuroprotective properties of lamotrigine in vivo. Epilepsia, 2013, 54(9): 1542-1550.

［2］ Nakatani Y, Masuko H, Amano T. The effect of lamotrigine on Na(v)1.4 voltage-gated sodium channels. J Pharmacol Sci, 2013, 123(2): 203-206.

518101 廣東省深圳市寶安區人民醫院