Keap1/Nrf2/ARE信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進展

李珊珊，陳忠云，李 婧，徐志偉，楊 旭

氧化應激廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理變化，腦缺血再灌注損傷是氧化應激的急性表現(xiàn)，慢性氧化應激亦是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。Keap1/Nrf2/ARE是迄今研究的最為重要的自身抗氧化應激通路。生理條件下，NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在細胞質(zhì)中與Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)結(jié)合，并通過Keap1蛋白將其錨定于由肌動蛋白構成的細胞骨架上，從而無法進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性；當受到親電試劑、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的刺激時，Keap1與Nrf2解偶聯(lián)使得Nrf2轉(zhuǎn)移入核，與基因中的Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識別抗氧化反應元件(antioxident response element,ARE)，啟動下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白類、泛素酶以及蛋白酶體的基因表達，提高細胞抗氧化應激能力。調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號通路從而調(diào)控其下游基因的表達，可能成為預防和治療氧化應激所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要方法。因此本文對Keap1/Nrf2/ARE信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用作一綜述。

1 腦血管疾病

1.1 缺血性卒中(ischemic stroke,IS) IS是指各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性變性壞死，是腦卒中的最常見類型。興奮性毒性、氧化應激、炎性反應以及線粒體功能障礙等病理過程參與IS的發(fā)生發(fā)展[1]，其中氧化應激作為腦卒中最為重要的損傷機制可以作為治療的潛在靶點。Nrf2是內(nèi)源性抗氧化應激的核轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)其表達后可以增加Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達，對腦卒中起到保護作用。Tanaka 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)后再灌注，2 h后Nrf2表達增加并在8 h達到高峰；其下游抗氧化蛋白谷胱甘肽(glutathione,GSH)以及血紅素加氧酶1(HO-1)在24～72 h梗死區(qū)域的表達亦顯著升高。大鼠MCAO模型中，側(cè)腦室或者腹腔內(nèi)注射Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)均可以降低運動、感覺功能和缺血后的梗死面積[3-4]。與此項研究類似，Nrf2敲除小鼠MCAO后90 min進行再灌注，其神經(jīng)功能缺損惡化并伴有梗死面積增加[5]。此外，Nrf2基因敲除小鼠的永久性MCAO模型中，其損傷后7 d的恢復情況亦顯著降低[3]。

活化Nrf2信號通路可以清除ROS，對IS損傷后具有神經(jīng)保護作用。Nrf2-/-小鼠腦損傷后可以產(chǎn)生更多的ROS[6]。為了明確Nrf2的抗氧化效果依賴于哪種細胞類型，Shih等[7]通過基于Nrf2過表達載體的腺病毒轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，得出星形膠質(zhì)細胞過表達Nrf2后，比神經(jīng)元細胞具有更強的抗氧化性能，其潛在機制可能是Nrf2過表達后星形膠質(zhì)細胞釋放出更多的GSH，從而保護神經(jīng)細胞免受過氧化氫(H2O2)的氧化作用。然而，另一項研究表明Nrf2-/-小鼠中性粒細胞釋放ROS，很可能是由于Nrf2可以上調(diào)GSH氧化還原體系同時抑制炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生[8]。TBHQ不僅可以保護原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞免受氧自由基的作用，同時可以保護細胞免受N-甲基-M-天冬氨酸(NMDA)或者谷氨酸鹽的興奮性毒性作用[5]，因此，可以假設Nrf2參與調(diào)節(jié)谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運體或者受體的表達。

1.2 腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH) ICH是指原發(fā)性非創(chuàng)傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，占急性腦血管病的20%～30%，亦是急性腦血管疾病中病死率最高的疾病。長期的高血壓使腦細動脈、小動脈發(fā)生玻璃樣變和纖維素樣壞死，管壁彈性減弱，血壓驟然升高時血管易破裂出血。出血后血腫形成，并伴有血腫周圍腦組織水腫，引起顱內(nèi)壓升高，使腦組織受壓移位后發(fā)生腦疝，腦疝是導致患者死亡的直接原因。隨后產(chǎn)生的腦缺血和氧化應激進一步加重ICH后腦損傷。Chen等[9]研究表明ICH后Nrf2信號通路被激活，同時伴有HO-1表達的增加，ICH后24 h HO-1表達上調(diào)，5 d時出現(xiàn)高峰，第8天時消退。HO-1主要在小膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞中度表達以及神經(jīng)元細胞少量表達。Zhao等[6]和Wang等[8]、Chen等[9]分別表明Nrf2-/-小鼠在ICH后神經(jīng)功能缺損和出血后損傷更為嚴重，提示Nrf2對于ICH后神經(jīng)保護具有重要作用。基于此研究Zhao等[6]通過腹腔注射Nrf2激動劑萊菔硫烷觀察到激活Nrf2信號通路對ICH具有保護作用，可以減少氧化應激、腦水腫及炎癥的產(chǎn)生；Sun等[10]通過姜黃素也驗證了這些作用。雖然以上研究均驗證了激活Nrf2信號通路的保護作用，但是其下游酶的表達并沒有闡述。

1.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH) SAH是指有血液流入蛛網(wǎng)膜下腔，分為原發(fā)性和繼發(fā)性。其主要病因是顱內(nèi)動脈瘤和腦血管畸形，病變血管可自發(fā)破裂，或者因為血壓突然增高導致血管破裂，血液進入蛛網(wǎng)膜下腔，通過圍繞在腦和脊髓周圍的腦脊液迅速播散，刺激腦膜引起腦膜刺激征，同時顱內(nèi)容量的增加引起顱內(nèi)壓增高，甚至是腦疝。Wang等[11]在實驗性SAH大鼠基底動脈的內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞上均檢測到Nrf2被激活，表現(xiàn)為Nrf2在細胞核內(nèi)表達增加以及與ARE結(jié)合。亦有研究發(fā)現(xiàn)在SAH的大腦動脈[12]、小膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞[13]中HO-1表達上調(diào)。激活Nrf2信號通路對SAH亦起到保護作用。姜黃素可以減少小鼠ICH后血管炎癥和痙攣[14]，并同時降低小鼠的氧化應激和死亡[15]。萊菔硫烷同樣可以活化Nrf2信號通路，上調(diào)其下游HO-1以及醌氧化還原酶1(NQO-1)等酶的表達，同時減少皮質(zhì)細胞的凋亡、腦水腫以及血-腦脊液屏障的損傷[16]。除了這些經(jīng)典的Nrf2激動劑，已有報道稱促紅細胞生成素[17]和褪黑素[18]同樣可以活化Nrf2信號通路，對SAH后腦損傷起到保護作用；促紅細胞生成素和褪黑素可以上調(diào)HO-1和NQO-1等Ⅱ相解毒酶的產(chǎn)生，減少大腦皮質(zhì)細胞凋亡并保護血-腦脊液屏障。HO-1的表達上調(diào)對SAH起到保護作用，可以衰減SAH的血管痙攣。

2 神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病

2.1 帕金森病(parkinson disease,PD) PD是一種無法治愈的運動障礙性疾病，其特征性病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失，殘留的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)有Lewy小體形成。5例PD患者尸檢數(shù)據(jù)表明在黑質(zhì)神經(jīng)元的細胞核中存在Nrf2的高表達[19]。這一現(xiàn)象與卒中氧化應激的保護作用相一致，PD患者神經(jīng)元細胞核中Nrf2的表達上調(diào)很可能是對抗氧化毒性反應的一種代償性表現(xiàn)，從而增強機體的抗氧化防御系統(tǒng)。而氧化應激一直是PD發(fā)病機制的研究熱點。

PD中Nrf2的保護作用通過臨床上應用B型單胺氧化酶抑制劑——丙炔苯丙胺(司來吉蘭)得到證實。最近研究顯示丙炔苯丙胺的作用依賴于其對Nrf2的激活[20]。Nrf2也可能參與了DJ-1/PARK7基因的神經(jīng)保護作用，這種基因在1%～2%的早期家族性PD患者中發(fā)現(xiàn)。DJ-1通過抑制Nrf2與Keap1的結(jié)合從而降低Nrf2的泛素化。此外，在DJ-1基因敲除的小鼠中TBHQ不能持續(xù)誘導Nrf2的核轉(zhuǎn)位[21-22]。DJ-1基因缺陷的患者表現(xiàn)為Nrf2下游基因表達的減少并且易受氧化應激的影響[23-24]。因此，與DJ-1基因突變相關的早期家族性PD的發(fā)病機制可能與Nrf2相關。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)只有Nrf2表達的星形膠質(zhì)細胞能夠減少1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的神經(jīng)毒性,再次驗證了星形膠質(zhì)細胞的Nrf2對PD模型的神經(jīng)保護起主要作用。此外，TBHQ誘導的大部分基因的保護作用主要發(fā)生在星形膠質(zhì)細胞中[26]，星形膠質(zhì)細胞再通過GSH間接支持神經(jīng)元的活動。

2.2 阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD) AD是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，病理學上表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、顆粒空泡變性、廣泛神經(jīng)元缺失及軸索和突觸異常、星形膠質(zhì)細胞反應、小膠質(zhì)細胞反應和血管淀粉樣變。研究發(fā)現(xiàn)在海馬神經(jīng)元內(nèi)AD患者細胞核內(nèi)Nrf2的表達明顯減少[19]。此外在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠上亦顯示Nrf2/ARE的下游蛋白減少[27]。由于氧化應激是AD發(fā)病機制中必不可少的因素，氧化應激激活Nrf2信號通路，故而對于Nrf2核轉(zhuǎn)位減少以及Ⅱ相解毒酶表達的減少能否參與AD的病理改變及神經(jīng)元的死亡十分必要。

最近研究表明了Nrf2/ARE信號通路在AD模型中的作用及其潛在的治療價值。通過TBHQ誘導Nrf2的活性增加或通過腺病毒介導的基因傳遞引起的Nrf2過表達均保護了Aβ1-42誘導的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的死亡[27]。在體實驗通過傳遞慢病毒編碼的人類雙邊Nrf2基因到APP/PS1小鼠的海馬中，可以緩解小鼠的空間學習能力障礙，并明顯減少星形膠質(zhì)細胞的浸潤。另一項研究表明，給予Aβ注射的大鼠TBHQ可以減少Aβ的沉積及其誘導的細胞凋亡[28]。這些研究表明激活Nrf2信號通路對AD模型的保護作用。

2.3 肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) ALS是運動神經(jīng)元病中最為常見和最易識別的表型，是一種病因未明的選擇性侵犯脊髓前角細胞、腦干后組運動神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體束細胞及錐體束的慢性進行性神經(jīng)變性疾病，表現(xiàn)為上、下運動神經(jīng)元同時受損。流行病學研究表明，90%～95%的為散發(fā)性ALS，家族性ALS占5%～10%。其中銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變與之有關已被公認，在散發(fā)性病例中占1%～4%、家族遺傳性病例中約20%存在該基因的突變。SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是ALS最為常用的模型[29]。

Pehar等[30]在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠上發(fā)現(xiàn)Nrf2及GSH相關酶的生物合成均減少。同樣，通過微陣列分析技術顯示，具有SOD1突變體的NSC34細胞的Nrf2轉(zhuǎn)錄基因同樣被抑制[31]。在5例ALS患者的尸檢中，發(fā)現(xiàn)大腦初級運動皮層區(qū)和脊髓內(nèi)的Nrf2蛋白和mRNA水平均降低。此外，ALS患者的運動皮層區(qū)Keap1的mRNA增高，但是在蛋白水平?jīng)]有得到驗證[32]。新近研究表明，SOD1突變的星形膠質(zhì)細胞對周圍的運動神經(jīng)元具有ALS毒性作用，而在膠質(zhì)酸性蛋白誘導下的星形膠質(zhì)細胞Nrf2過表達則可以逆轉(zhuǎn)這種毒性，提高小鼠的生存時間[33]。這一結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細胞中的Nrf2的激活對神經(jīng)元具有保護作用。

3 展望

Nrf2作為抗氧化應激的重要調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點。眾多研究已經(jīng)表明，Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護作用，但其機制有待進一步探討研究。目前的研究已經(jīng)表明，Nrf2激動劑萊菔硫烷和TBHQ對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，但是仍然需要尋找對人體更為安全有效且能順利通過血-腦脊液屏障的藥物。

綜上所述，Keap1/Nrf2/ARE信號通路可以作為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個新的靶點，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療發(fā)揮重要作用。

1 Lo EH,Dalkara Y,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

2 Tanaka N,Ikeda Y,Ohta Y,et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2011,1370:246-253.

3 Shih AY,Li P,Murphy TH.A small-molecule-inducible Nrf2-mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J].J Neurosci,2005,25(44):10321-10335.

4 Zhang F,Wang S,Zhang M,et al.Pharmacological induction of heme oxygenase-1 by a triterpenoid protects neurons against ischemic injury[J].Stroke,2012,43(5):1390-1397.

5 Shah ZA,Li RC,Thimmulappa RK,et al.Role of reactive oxygen species in modulation of Nrf2 following ischemic reperfusion injury[J].Neuroscience,2007,147(1):53-59.

6 Zhao X,Sun G,Zhang J,et al.Transcription factor Nrf2 protects the brain from damage produced by intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2007,38(12):3280-3286.

7 Shih AY,Johnson DA,Wong G,et al.Coordinate regulation of glutathione biosynthesis and release by Nrf2-expressing glia potently protects neurons from oxidative stress[J].J Neurosci,2003,23(8):3394-3406.

8 Wang J,Fields J,Zhao C,et al.Role of Nrf2 in protection against intracerebral hemorrhage injury in mice[J].Free Radic Biol Med,2007,43(3):408-414.

9 Chen M,Regan RF.Time course of increased heme oxygenase activity and expression after experimental intracerebral hemorrhage:correlation with oxidative injury[J].J Neurochem,2007,103(5):2015-2021.

10 Sun KH,Chang KH,Clawson S,et al.Glutathione-S-transferase P1 is a critical regulator of Cdk5 kinase activity[J].J Neurochem,2011,118(5):902-914.

11 Wang Z,Chen G,Zhu WW,et al.Activation of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2(Nrf2) in the basilar artery after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Ann Clin Lab Sci,2010,40(3):233-239.

12 Ono S,Zhang ZD,Marton LS,et al.Heme oxygenase-1 and ferritin are increased in cerebral arteries after subarachnoid hemorrhage in monkeys[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(7):1066-1076.

13 Matz P,Turner C,Weinstein PR,et al.Heme-oxygenase-1 induction in glia throughout rat brain following experimental subarachnoid hemorrhage[J].Brain Res,1996,713(1/2):211-222.

14 Wakade C,King MD,Laird MD,et al.Curcumin attenuates vascular inflammation and cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(1):35-45.

15 Kuo CP,Lu CH,Wen LL,et al.Neuroprotective effect of curcumin in an experimental rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Anesthesiology,2011,115(6):1229-1238.

16 Chen G,Fang Q,Zhang J,et al.Role of the Nrf2-ARE pathway in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Neurosci Res,2011,89(4):515-523.

17 Zhang J,Zhu Y,Zhou D,et al.Recombinant human erythropoietin(rhEPO) alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats:possible involvement of Nrf2-ARE pathway[J].Cytokine,2010,52(3):252-257.

18 Wang Z,Ma C,Meng CJ,et al.Melatonin activates the Nrf2-ARE pathway when it protects against early brain injury in a subarachnoid hemorrhage model[J].J Pineal Res,2012,53(2):129-137.

19 Ramsey CP,Glass CA,Montgomery MB,et al.Expression of Nrf2 in neurodegenerative diseases[J].J Neuropathol Exp Neurol,2007,66(1):75-85.

20 Xiao H,Lv F,Xu W,et al.Deprenyl prevents MPP(+)-induced oxidative damage in PC12 cells by the upregulation of Nrf2-mediated NQO1 expression through the activation of PI3K/Akt and Erk[J].Toxicology,2011,290(2/3):286-294.

21 Clements CM,McNally RS,Conti BJ,et al.DJ-1,a cancer- and Parkinson′s disease-associated protein,stabilizes the antioxidant transcriptional master regulator Nrf2[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(41):15091-15096.

22 Gan L,Johnson DA,Johnson JA.Keap1-Nrf2 activation in the presence and absence of DJ-1[J].Eur J Neurosci,2010,31(6):967-977.

23 Mosser DM,Edwards JP.Exploring the full spectrum of macrophage activation[J].Nat Rev Immunol,2008,8(12):958-969.

24 Zhou W,Freed CR.DJ-1 up-regulates glutathione synthesis during oxidative stress and inhibits A53T alpha-synuclein toxicity[J].J Biol Chem,2005,280(52):43150-43158.

25 Chen PC,Vargas MR,Pani AK,et al.Nrf2-mediated neuroprotection in the MPTP mouse model of Parkinson′s disease:Critical role for the astrocyte[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(8):2933-2938.

26 Kraft AD,Johnson DA,Johnson JA.Nuclear factor E2-related factor 2-dependent antioxidant response element activation by tert-butylhydroquinone and sulforaphane occurring preferentially in astrocytes conditions neurons against oxidative insult[J].J Neurosci,2004,24(5):1101-1112.

27 Kanninen K,Malm TM,Jyrkkanen HK,et al.Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 protects against beta amyloid[J].Mol Cell Neurosci,2008,39(3):302-313.

28 Nouhi F,Tusi SK,Abdi A,et al.Dietary supplementation with tBHQ,an Nrf2 stabilizer molecule,confers neuroprotection against apoptosis in amyloid beta-injected rat[J].Neurochem Res，2011,36(5):870-878.

29 Gurney ME,Pu H,Chiu AY,et al.Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation[J].Science，1994,264(5166):1772-1775.

30 Pehar M,Vargas MR,Robinson KM,et al.Mitochondrial superoxide production and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activation in p75 neurotrophin receptor-induced motor neuron apoptosis[J].J Neurosci,2007,27(29):7777-7785.

31 Kirby J,Halligan E,Baptista MJ,et al.Mutant SOD1 alters the motor neuronal transcriptome:implications for familial ALS[J].Brain,2005,128(Pt 7):1686-1706.

32 Sarlette A,Krampfl K,Grothe C,et al.Nuclear erythroid 2-related factor 2-antioxidative response element signaling pathway in motor cortex and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis[J].J Neuropathol Exp Neurol,2008,67(11):1055-1062.

33 Vargas MR,Johnson DA,Sirkis DW,et al.Nrf2 activation in astrocytes protects against neurodegeneration in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis[J].J Neurosci,2008,28(50):13574-13581.