骨髓間充質干細胞和抗生素對乳腺炎模型大鼠血清中急性期蛋白水平的影響

王 波 張 彤

(東風公司總醫院外科，湖北 十堰 442008)

乳腺炎是女性哺乳期常發的一種疾病，主要是由于乳腺排乳不暢導致乳汁淤積加上細菌感染所致〔1〕。其是一種典型的炎性變化〔2〕，表現為紅、腫、熱、痛。大腸桿菌是臨床最常見的乳腺炎菌株，發生乳腺炎時病原體與其產生的內毒素(LPS)等能誘導乳腺局部炎癥細胞的浸潤，從而導致體內的腫瘤壞死因子(TNF-α)白細胞介素(IL)-6、C反應蛋白(CRP)等炎性細胞因子增加。一方面這些細胞因子能夠趨化免疫細胞從而清除病原體；另一方面炎癥發展也會引起乳腺的微循環障礙，導致乳腺組織壞死、無乳、化膿，長期還會導致纖維化進而永久喪失泌乳功能〔3〕，因此采用適宜的方法控制乳腺炎患者體內炎癥的發展對乳腺炎的治療作用重大。大量研究表明骨髓間充質干細胞(BMSCs)除了保留一部分的多向分化能力以外，其還具有明顯的免疫調節功能〔4〕，能降低受損部位的炎癥反應，對受損組織起到保護作用。本研究向乳腺炎模型的SD大鼠乳房基部注射一定量的BMSCs或抗生素，旨在研究其對乳腺炎大鼠血清中的炎性細胞因子水平，以期為乳腺炎的治療提供新的思路與依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑 大腸桿菌內毒素(LPS)購自SIGMA公司；L-DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；大鼠TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP ELISA試劑盒購自Bender公司。注射用氨芐西林鈉0.5 g購自張家界市長康制藥有限責任公司。

1.2分組及設計 體重約350 g SPF級待產大鼠80只購自武漢大學實驗動物中心。采用乳頭管灌注內毒素的方法建立乳腺炎模型。灌注內毒素后24 h定義為d0，分為正常對照組、對照組、抗生素組、BMSCs組。正常對照組5只，其余每組25只，分別于d1、d3、d5、d7各組分別采取斷尾法獲取血液，制備血清，置于-80℃冰箱保存待測。正常對照組不注射LPS于-d1直接取血清檢測，對照組、抗生素組、BMSCs組于產后72 h經乳頭管注入50 μl，1 μg/μl LPS，24 h觀察乳腺感染情況，有明顯乳腺發紅、腫脹、局部溫度升高的納入實驗〔5〕。治療方案均為往乳房基部注射，對照組注射生理鹽水，抗生素組注射抗生素50 μl(5 000 U/側，注射LPS后24 h與48 h注射2次)，BMSCs組注射BMSCs 50 μl(106個，注射內毒素后24 h注射1次)

1.3BMSCs的制備與培養 頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精浸泡消毒，無菌取雙側股骨和脛骨，于磷酸鹽緩沖液(PBS)中剪斷兩端骨骺，PBS反復沖洗骨髓腔，直到骨髓腔清亮，用NH4Cl紅細胞裂解液去除紅細胞，收集骨髓細胞，移至培養瓶(含10%FBS的L-DMEM)中，輕輕搖勻，置于CO2細胞培養箱中培養。48 h后換新鮮培養基除去未貼壁的細胞，以后每隔3天換一次液，當貼壁細胞達到80%融合后，0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶3的比例傳代培養。取第3代細胞留用。

1.4ELISA檢測 根據試劑盒說明書繪制標準曲線，采納相關系數>0.99的標準曲線。每組先等量混合5只小鼠血清后成為一個樣品，每個樣品做3個復孔，取各孔平均值，檢測過程無異常。

2 結 果

用ELISA方法檢查不同組在不同時間點的血清中急性時相反應蛋白的濃度，發現注射內毒素24 h后所有乳房腫脹、局部溫度升高的小鼠的TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP均明顯上升(均P<0.05)，對照組各炎性細胞因子在觀察期間均逐漸下降。使用抗生素與BMSCs后d1～d7 TNF-α、IL-8均比d0低且TNF-α還比同日對照組要低(均P<0.05)，使用BMSCs則使CRP持續低于對照組(P<0.05)，BMSCs組d5、d7的IL-6明顯高于同日對照組(P<0.05)。BMSCs組的IL-1β只有d7與同日對照組無統計學意義(P>0.05)，d1、d3、d5均低于對照組(均P<0.05)，與同日抗生素組對比，IL-8與CRP在d5、d7均比抗生素組要低(P<0.05)。見表1。

表1 處理后各組血清炎性細胞因子濃度

3 討 論

乳腺炎的致病菌以大腸桿菌最為常見，而LPS是其致病的主要物質之一，其感染乳房后能引起乳房紅、腫、熱、痛。當前實驗用乳腺炎動物模型的主要方法是采用乳房內注射LPS〔5〕。乳腺炎的預后與轉歸與其炎癥發展進程緊密相關，及早地清除病原體并去除局部炎癥環境是其治療的主要目的。為了研究乳腺炎發展過程中體內炎癥反應的發展狀況，本研究采用乳頭管灌注LPS的方法建立乳腺炎模型，模型小鼠均表現為乳房腫脹與局部發熱，且其血清中的炎性細胞因子濃度均上升，說明本實驗成功建立了乳腺炎模型。

LPS誘導的急性炎癥反應與細胞因子的含量升高關系密切，且炎性細胞因子還能繼發性的導致浸潤到局部的炎癥細胞增多〔6〕，中性粒細胞和巨噬細胞就是早期浸潤的細胞，巨噬細胞能產生TNF-α、IL-6、IL-8，又能使中性粒細胞產生更多的炎癥因子及增強其脫顆粒能力，增加組織中的髓過氧化物酶(MPO)量，MPO使血管內皮腫脹、血小板淤積導致乳腺內微循環障礙，乳房腫脹疼痛〔7〕。BMSCs能表達Toll樣受體(TLR4)，能與LPS結合表現出與巨噬細胞、LPS結合不一樣的效應，前者能促進自身分化并阻止其余巨噬細胞的結合，或誘導巨噬細胞分泌抗炎性細胞因子，二者結合后主要起到識別病原體、激活自身已達到清除病原體的作用。這可能是BMSCs能降低乳腺炎炎癥反應程度的機制之一。

本研究發現，在小鼠不采取治療方案的對照組各炎性細胞因子在觀察期間均表現為逐漸下降，這可能和其炎癥在逐漸自身消退有關，使用抗生素與BMSCs后TNF-α、IL-8明顯低于對照組。BMSCs還能使CRP持續低于對照組，這與BMSCs能保護受損組織，降低其局部炎癥反應有關〔7～9〕。采取注射LPS方式模擬的乳腺炎組織中病原菌數量較少，而抗生素也能起到類似BMSCs降低炎癥反應的作用，可能和抗生素其自身也能進入炎癥細胞里且還能破壞炎癥細胞的吞噬功能相關〔10〕。IL-2的水平在各組區別無統計學差異，其可能是注射BMSCs的次數與數量較少所致，也可能是由于IL-2主要由激活的輔助T細胞產生，在觀察期內，還沒有完全發揮作用。

乳腺是一個功能調控比較復雜的組織，受到眾多因子的影響，包括神經遞質、抗體、酶、細胞因子等。乳腺炎發生后，局部及全身過度表達的炎癥細胞因子會影響乳腺炎的預后，導致其功能發生紊亂。本研究為進一步采取降低炎性反應的方法治療乳腺炎提供了一些依據。

4 參考文獻

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