熒光定量分型PCR法與直接測序法檢測HBV-DNA水平的應用價值比較

劉 青

黃河中心醫院檢驗科，河南鄭州 450003

乙型病毒性肝炎是世界常見的感染性疾病之一，全球約有3.5億慢性感染患者[1]，我國乙型肝炎病毒感染患者約有1.2億，每年死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及肝癌的患者約有100萬[2]。根據HBV-DNA全基因組序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%，臨床上一般將HBV分為A～H型，共計8個基因型[3]，我國主要分布的是B型、C型以及B、C混合型。對HBV感染患者進行正確分型，是指導下一步診斷治療的重要依據。目前，臨床上常用的有熒光定量分型PCR法與直接測序法。為比較熒光定量分型PCR法與直接測序法檢測HBV-DNA水平的應用價值。該研究2012年1月—2013年12月間擬通過對該院收治的126例HBV患者分別采用熒光定量分型PCR法與直接測序法檢測HBV-DNA水平，以比較兩種方法的應用價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院收治的126例符合入選標準的HBV患者，其中男性 74 例，女性 52 例；年齡為 21～64 歲，平均（48.13±10.72）歲；病程為 6 個月～6 年，平均（2.67±0.47）歲。

1.2 納入與排除標準

①符合中華醫學會關于乙型病毒性肝炎的診斷標準[4]；②HBsAg陽性；③排除心、肺、腎等功能嚴重障礙患者；④排除妊娠及哺乳期女性患者；⑤排除合并其他可對實驗結果造成影響的疾病患者；⑥自愿參加并簽署知情同意書。

1.3 主要儀器和試劑

主要儀器包括CFX96實時定量PCR儀 （美國Bio-Rad公司），ABI3100基因分析儀（美國ABI公司）。主要試劑包括Premix Taq PCR擴增試劑盒及DNA Marker（TaKaRa公司）。

1.4 檢測方法

采集HBV患者空腹靜脈血，離心，利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒從血清中提取HBV-DNA，溶于DEPC處理水，-20℃保存。

1.4.1 熒光定量分型PCRPCR反應總體積20μL，包括PCR反應混合液10μL，DNA模板 2μL，0.3μmol/LB型探針 2μL，0.3μmol/L C型探針 2μL，0.5μmol/LB、C型引物 2μL。CFX96實時定量PCR儀進行擴增，CFXManagerTM1.1軟件行數據分析處理。

1.4.2 直接測序法 選用引物對基因S區進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性處理5min，55℃處理30s，72℃處理30s。雙脫氧鏈末端終止法擴增測序片段并純化，ABI3100基因分析儀進行序列分析。采用NCBI工具行基因分型。

1.4.3 TA克隆 若樣本經兩種方法檢測結果不一致，則行TA克隆，挑選20～40個陽性克隆，對單菌落測序進行基因型檢測。

1.5 統計方法

采用SPSS18.0統計學軟件進行數據的分析和處理。率的比較采用χ2檢驗，兩種檢測方法基因分型結果進行一致性檢驗。

2 結果

2.1 基因分型

126份樣本經兩種方法檢測均成功分型，只檢測出3種基因分型（B型、C型、B/C混合型），其中B型占明顯優勢。熒光定量分型PCR法B/C混合型檢出率明顯高于直接測序法，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 兩種檢測方法HBV-DNA基因分型結果比較[n（%）]

2.2 結果一致性檢驗

對兩種檢測方法的HBV-DNA基因分型結果進行一致性檢驗，Kappa＞0.75，表明兩種檢測方法的一致性較好，見表2。

表2 兩種檢測方法HBV-DNA基因分型結果一致性檢驗（n）

2.3 TA克隆

共計23份樣本經兩種方法檢測的HBV-DNA基因分型結果不一致，從中隨機抽選8份樣品（熒光定量分型PCR法檢測結果為B/C混合型，直接測序法檢測結果為單一基因分型）進行TA克隆，分別選出30個克隆之后進行測序的基因型，結果示8分樣品均存在B/C混合感染，該結果與熒光定量分型PCR法一致。

3 討論

乙型肝炎病毒是雙鏈DNA病毒，可導致急、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌，其基因序列高度變異，這是因為HBV的逆轉錄酶缺乏校正活性，復制過程中可產生大量的核苷酸錯配，HBV的變異率比其他DNA病毒高10倍以上[5]。我國大陸地區主要以B和C基因型為主，南方以B基因型為主，北方則以C基因型為主，有研究表明我國寧夏地區、廣東地區及香港地區約有15%的乙肝病毒感染者基因型為D型[6]。也有研究表明肝癌患者中的C基因型比例明顯高于慢性乙型肝炎患者中的C基因型比例[7]，而在乙型肝炎病毒攜帶者中未檢測到C基因型，因此對乙型肝炎病毒進行基因分型，對乙型肝炎患者的治療及預后判斷具有重要意義。隨著分子生物學檢測技術的發展，出現了多種乙型肝炎病毒耐藥變異及基因分型的檢測方法，主要包括直接測序法、PCR分型法、聚合酶反應法、雜交法及酶聯免疫法[8]。DNA直接測序法，被公認為HBV基因耐藥變異檢測的金標準，既可以得到已知變異點的信息，還可以提示可能的未知的耐藥變異位點，但缺點是靈敏性差，當變異株超過HBV準種池的20%時才能被發現。熒光定量分型PCR法是一種新興的應用于臨床的方法，目前主要包括兩種方法，即溶解曲線法和特異性探針法。熒光定量分型PCR法特異性和敏感性均較好，操作相對較簡便，降低了檢測過程中受污染的可能性，逐漸在臨床上推廣應用。該研究通過對126例HBV患者分別采用熒光定量分型PCR法與直接測序法檢測HBV-DNA水平，發現熒光定量分型PCR法B/C混合型檢出率（25.40%）明顯高于直接測序法（7.14%），經統計學分析表明，差異有統計學意義（P＜0.001）；TA克隆結果與熒光定量分型PCR法一致。該結果表明，熒光定量分型PCR法檢測結果準確可靠，與直接測序法相比，對于混合型HBV-DNA檢出率明顯占優勢，敏感性較高。綜上所述，熒光定量分型PCR法檢測HBVDNA水平應用價值較直接測序法高，值得臨床推廣應用。

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