二維電泳和質譜技術在大腸癌與正常腸組織相關差異表達蛋白中的應用

佟雪梅

(北京威泰科生物技術有限公司研發部，北京 100070)

大腸癌(CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率隨年齡而增長〔1，2〕。早期發現、早期診斷、早期開展規范化的手術治療是提高CRC療效的關鍵〔3〕。近年來蛋白質組學被逐漸應用于臨床研究等領域，其研究結果更直接地用于疾病的預防、診斷和治療,其中二維電泳和質譜技術應用最廣泛〔4，5〕。本文通過研究二維電泳和質譜技術在CRC與正常腸組織相關差異表達蛋白,篩選出CRC的早期診斷標志物,從而為CRC的早期診斷和治療提供科學依據。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇某院確診為CRC的15例患者，其中男8例，女7例，年齡30～62〔平均(36.20±7.09)〕歲，分別取其手術切除樣本15例為CRC組，取距腫塊15 cm以上的大腸組織15例為對照組，標本以低溫生理鹽水沖洗干凈，除去污漬和血液，置于液氮冷存備用。所有病人術前均未行化療、放療和其他生物治療。

1.2方法

1.2.1組織標本蛋白質抽提〔6〕取50 mg組織標本在液氮下充分研磨至粉末狀，加入裂解液：6.5 mol/L urea，2%NP，2 mol/L硫脲，1%聚乙二醇辛基苯基醚，100 mol/L二硫蘇糖醇,5 mmol/L苯甲基磺酰氟，4%乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸鹽(CHAPS)，40 mmol/L三羥甲基氨基甲烷，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，2% pharmalyte，0.25 mg/ml核糖核酸酶A 1 mg/ml，胰脫氧核糖核酸酶400 μl，充分混勻，然后置于37℃孵育1 h，取出后再混勻，4℃ 15 000 r/min離心3 min，所得的上清液即為組織總蛋白。最后通過二喹啉甲酸(BCA)法測定樣本的蛋白質濃度。

1.2.2組織標本蛋白質濃度測定 用2.0 mg/ml的牛血清白蛋白配制出濃度梯度為0.125、0.25、0.5、1、1.5 mg/ml的標準蛋白，在波長570 nm下用酶標儀檢測各濃度的光密度值。以標準蛋白濃度為橫坐標，相應的光密度值為縱坐標繪制標準曲線，得到直線回歸方程，最后將待測蛋白樣本的光密度值帶入此方程算出所測蛋白質的濃度。

1.2.3二維電泳〔7〕參照《雙向電泳原理與方法》：將蛋白樣品(400 μg)與水化液(300 μl)充分混合振蕩后上樣，加入pH梯度干膠系(IPG)持膠槽(避免產生氣泡)，再將IPG膠條去掉保護膜后，以膠面向下的方式將IPG膠條放入電泳槽進行IEF電泳，加上覆蓋液，置于IPGphor等電聚膠儀上，水化和聚焦在20℃自動進行，總電壓時間積為52 420 Vh，其中30 V低電壓水化14 h，然后經過500 Vh，1 000 Vh，3 000 V 0.5 h，5 000 V 0.5 h，6 000 V 0.5 h，7 000 V 0.5 h，8 000 V 5 h，最大電流55 μA。電泳結束后取出膠條、沖洗及平衡。將膠條放于十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)膠筒上進行第二向電泳。根據正負極標志連接好電泳槽和電源，打開電源開關，先以30 mA恒流慢速電泳20 min(15 mA，根)，20 min后以60 mA恒流電泳，溴酚藍標志線接近凝膠底部時電泳結束。

1.2.4凝膠圖案分析〔8〕首先用Labscan掃描軟件和Imagescaner掃描儀對凝膠進行掃描得到相應圖像，然后利用PD-quest7.3軟件分別對結腸癌和正常腸組織的雙相電泳圖像進行校正點檢測、背景消減與點匹配、1D與2D棱正，進而建立平均凝膠，量化得到的蛋白斑點的信息。

1.2.5質譜分析〔9〕選取二維電泳圖像分析得到的差異蛋白質點，在凝膠上取得這些點，依次進行脫色、烷基化、沖洗、脫水至完全干燥。然后依次進行酶解、萃取、離心和脫鹽。最后將樣品與基質液混合充分后取其混合液點樣于點樣板上，待樣本自然風干進行質譜分析〔10〕。質譜分析步驟：將點樣板置于質譜儀中進行分析，得到指紋圖案，利用Profound軟件在蛋白質序列數據庫中搜索該指紋數據，確定各點所屬蛋白。

1.3檢測試劑和儀器 固相IPG pH 3～10、裂解液、BCA、牛血清白蛋白、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、鐵氰化鉀、碘乙酰胺、三氟己酸、胰蛋白酶等(Sigma提供)。離心機、酶標儀、IPGphor等電聚膠儀、SDS-PAGE膠筒、實驗常用儀器等(Sigma提供)。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1二維電泳結果分析 CRC樣本和對照組樣本均采用二維電泳方法獲得蛋白質雙向電泳圖譜后，另外在相同條件下對同一蛋白樣品進行3次雙向電泳后發現：蛋白斑點主要聚集在pH 4～8、分子量20～100 kD范圍；CRC組的平均蛋白質點數為974±28，而對照組為632±19，兩組比較具有統計學差異(P<0.05)；兩組3塊膠中的蛋白質點在其位置上均有較好的重復性，兩兩間的匹配度最高可達到90.0%； IEF方向上，大腸癌組的偏差平均值分別為(0.713±0.204) mm，對照組為(0.582±0.193) mm，兩組在IEF方向上的偏差具有統計學差異(P<0.05)； SDS-PAGE方向，大腸癌組偏差平均值為(0.977±0.372) mm，對照組為(1.170±0.412) mm，兩組在SDS-PAGE方向的偏差具有統計學差異(P<0.05)。差異蛋白質點的確定標準為：蛋白質點的表達量與所匹配蛋白質點的表達量總和比值>3，且同組3塊膠圖譜中均出現相同變化的蛋白點。研究發現，兩組的差異蛋白質點數為75.20±18.76。

2.2質譜分析結果 在大腸癌組和對照組的二維電泳圖譜中，選取其中大腸癌組表達高于對照組的蛋白質點36個進行質譜分析。以Mowse分為基礎概率評價數據庫搜尋結果的質量，分值大小表示鑒定蛋白隨機匹配的可能性，匹配分值大于63說明具有顯著性意義。本研究鑒定的36個點中，質譜分析鑒定CRC異常表達蛋白類型有ACTB protein、annexin Ⅱ、annexinⅣ、APOALPROTEIN、 calreticulin precursor、 fatty acid-binding protein、hepatic、Actin bata、11s regulator, chain B、HSP27、pregnancy-specific glcoprotein、Chaperonin containing TCP 1、Transgelin、glutathione s-transferase、tubulin beta chain、triosephosphate isom erase、serum album in, chain A。

3 討 論

CRC在遺傳因素和環境的綜合作用下，經歷多步驟、多基因及多階段復雜的生物學過程。結直腸上皮細胞增生-腺瘤-非典型增生-癌-轉移癌為CRC發生發展的模式。在其發病的不同時期，腫瘤細胞由于基因組改變進而產生一些與腫瘤相關或者一些腫瘤特異的小分子蛋白質，另外還可能分泌一些細胞因子或相關抗體，這些物質釋放到血液成為CRC的相關血清腫瘤標志物〔11〕。CRC目前在我國惡性腫瘤中列第5位，其發病率和死亡率呈逐年增高的趨勢，盡管近年診治水平有明顯提高，但病死率仍居高不下，其主要原因就是CRC很難被早期發現，大部分患者到中晚期才被確診，從而錯過了手術的最佳時機〔12〕。因此，研究CRC的發生機制、發現CRC特異性標志物及研究其相應的檢測技術已然成為目前CRC防治的關鍵問題。

在腫瘤生物標志物篩選檢測技術方面，高通量生物技術應用較為廣泛, 包括基因芯片, 蛋白質組學技術/蛋白質芯片等〔13〕。蛋白質組學以細胞內全部蛋白的存在及其活動方式為研究對象，研究的內容是識別及鑒定一種細胞或組織的蛋白質表達模式〔13〕。其中二維電泳，又稱為二維APGE電泳，結合了等電聚焦技術(根據蛋白質等電點進行分離)以及SDS-PAGE電泳技術(根據蛋白質大小進行分離)，是表達蛋白質組學研究的有效手段之一，是目前唯一能將上萬個蛋白質點同時分離與展示的技術〔14〕。質譜法是利用電磁學原理，對荷電分子或亞分子裂片依其質量和電荷的比值(質荷比，m/z)進行分離和分析的方法，在腫瘤標志物的檢測上應用廣泛〔12〕。采用蛋白質組學技術篩選CRC發生發展相關蛋白是可行、有效的。

4 參考文獻

1葉任高.內科學〔M〕.第5版.北京:人民衛生出版社,2000:1231-4.

2馬曉強,李 海,侍明海,等.221例大腸癌臨床分析〔J〕.寧夏醫科大學學報,2008;30(6):756-7.

3呂仙梅,鄭 堅,朱瑩杰,等.中醫藥聯合化療對大腸癌Ⅱ、Ⅲ期患者生存期的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志,2012;32(9):1166-70.

4陳主初.腫瘤蛋白質組學的研究進展〔J〕.癌癥,2004;23(2):113-7.

5李 峰,關勇軍,陳主初,等.蛋白質組學及其在腫瘤研究中的應用〔J〕.生物化學與生物物理進展,2001;28(2):164-7.

6劉志紅,曾 亮,鄧亞平,等.不同臨床分期大腸癌組織的二維電泳圖譜建立及質譜分析〔J〕.腫瘤基礎與臨床,2007;20(1):29-32.

7王振玲,王 棟,朱化彬,等.二維電泳分離牛精子蛋白技術〔J〕.中國生物工程雜志,2006;26(9):61-6.

8王浩飛,向祖瓊,王益鑫,等.人精子膜蛋白的二維電泳實驗研究〔J〕.中華男科學雜志,2003;9(7):504-6.

9王志武,孫萬春,周 悅,等.禽流感病毒H5N1病毒顆粒中雞胚宿主蛋白的質譜分析〔J〕.分析化學,2012;40(3):376-80.

10邢加迪,張連海,李晶晶,等.飛行時間質譜技術在結直腸癌K-ras基因突變檢測中的應用〔J〕.中華胃腸外科雜志,2013;16(1):80-3.

11王 競.Artemin和MMP-9在大腸癌中表達的關系〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(8):1769-70.

12李祖國.超分子免疫磁珠定量PCR技術的建立及大腸癌轉移相關標志物的探討〔D〕.廣州:第一軍醫大學博士論文,2006.

13韓金祥.腫瘤標志蛋白質組學研究及展望〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2008;15(20):1521-3.

14魏曉麗,王 悅.癌蛋白質組學技術及其應用〔J〕.基礎醫學與臨床,2008;28(10):1107-10.