金屬硫蛋白3對快速老化癡呆模型小鼠行為學變化的影響

馬飛煜 林 婉 黃林歡 林 麒

(汕頭市中心醫院暨中山大學附屬汕頭醫院神經內科，廣東 汕頭 515041)

快速老化癡呆模型小鼠(SAMP8)主要以學習記憶能力障礙為老化特征，是目前公認的比較理想的自然衰老癡呆模型〔1～4〕。快速老化小鼠對照系(SAMR1)表現為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照。Morris水迷宮是用來檢測嚙齒動物的空間學習能力、記憶能力的理想實驗系統〔5〕。Uchida等〔6〕首次從人腦組織中分離出金屬硫蛋白(MT)3，因其只在腦內特異表達，可能具有重要的神經生理和神經調節功能。臨床報道老年癡呆患者腦內MT3含量明顯減少〔7〕。本實驗應用Morris水迷宮檢測MT3對SAMP8小鼠學習記憶變化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 實驗動物均7月齡，雄性，每組各20只。SAMR1小鼠作為正常組。SAMP8隨機法分成癡呆組、空白對照組(0.2 ml/10 g 生理鹽水)、低濃度 MT3(75 μg/ml)組、中濃度 MT3(150 μg/ml)組、高濃度 MT3(300 μg/ml)組。由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法 連續腹腔注射不同濃度MT3及生理鹽水28 d，停藥1 d后采用Morris水迷宮進行定位航行試驗和空間探索試驗。Morris水迷宮包括一不銹鋼的圓形水池，將水池等分東南西北4個象限，每個象限標記1個入水點;任意將平臺設置于某1個象限中間，位置保持不變;一般平臺藏于水面下1～2 cm，水溫保持在 (22±1)℃。迷宮外參照物在實驗期間始終保持不變以供小鼠定位平臺。迷宮上方有攝像成像系統，自動錄入小鼠游泳軌跡并進行分析。

1.2.1 定位航行試驗 試驗歷時4 d，每天固定時間段，每個時間段訓練4次。訓練開始時，從池壁4個入水點的任一點將小鼠面向池壁放入水池。攝像系統記錄小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，4次訓練即將小鼠分別從4個不同的入水點放入水中。小鼠90 s內找不到平臺(潛伏期計為90 s)，則由實驗者將其拿上平臺，在平臺上休息15 s，再進行下一次試驗。每日以小鼠4次訓練潛伏期的平均值作為當日學習成績。

1.2.2 空間探索試驗 定位航行結束后撤除平臺，將小鼠任選1個入水點放入水中，所有小鼠必須為同一入水點，使其尋找記憶中原平臺，記錄100 s游泳軌跡，計算其穿越原平臺次數取平均值。

1.3 統計處理 應用SPSS10.0統計軟件進行多組間方差分析和兩組間t檢驗。

2 結果

2.1 各組逃避潛伏期比較 癡呆組逃避潛伏期〔(84.99±5.71)s〕比 SAMR1 組〔(40.98±3.74)s〕明顯延長(P＜0.01)，說明SAMP8小鼠具有明顯的學習能力下降的特征。低濃度MT3組逃避潛伏期為(76.75±5.42)s、中濃度 MT3 組為(71.02±5.22)s、高濃度 MT3 組(58.45±6.76)s。高濃度 MT3 組在 3 種濃度MT3組當中逃避潛伏期最短(P＜0.05);高濃度MT3組與空白對照組〔(86.52±8.1)s〕相比，逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，說明SAMP8小鼠經MT3治療，學習能力提高，有濃度依賴關系，高濃度作用最強。高濃度 MT3組逃避潛伏期比SAMR1組延長(P＜0.05)，說明經MT3治療，癡呆小鼠學習能力有改善，但仍未達到正常水平。

2.2 各組穿越原平臺次數比較 癡呆組穿越原平臺游泳的次數〔(3.29±1.41)次〕明顯比 SAMR1 組〔(8.15±1.74)次〕減少(P＜0.05)，說明 SAMP8小鼠具有明顯的記憶能力下降的特征。低、中、高濃度 MT3組穿越原平臺次數分別是(4.75±1.42)次、(5.02±1.22)次、(6.45±1.76)次。3 種濃度 MT3 組相比，高濃度MT3組最多(P＜0.05);高濃度MT3組與空白對照組〔(3.52±0.91)次〕相比，穿越原平臺的次數增多(P＜0.05)，說明SAMP8小鼠經MT3治療記憶能力提高，有濃度依賴關系，高濃度作用最強。高濃度MT3組穿越原平臺次數比SAMR1組明顯減少(P＜0.05)，說明經MT3治療，癡呆小鼠記憶能力有改善，但仍未達到正常水平。

3 討論

SAMP8小鼠是由日本京都大學Takeda教授開發，以學習記憶功能呈增齡性加速衰退為主要特征，成為了研究老化和學習記憶障礙的理想動物模型〔8～10〕。Morris水迷宮是英國心理學家Morris于1981年設計并應用于腦學習、記憶能力研究的首選經典實驗〔5〕。裝置實驗設計合理，方法簡便實用，被廣泛應用于學習記憶、老年癡呆、海馬研究、智力與衰老等方面的研究。在世界上已經得到廣泛地認可，涉及被試動物主要是鼠。主要的實驗內容主要包括定位航行試驗和空間探索試驗。

MT3只存在于中樞神經系統，對其生物學功能的認識，目前概括起來包括以下幾個方面:①對Cu、Zn等金屬的隔離與分散作用;②調控鋅金屬蛋白的生物合成及活性;③保護細胞免受自由基傷害;④特定情況下對神經元細胞生長的抑制作用。而目前MT3對AD的保護作用機制尚未清楚，實驗發現MT3可以提高SAMP8小鼠海馬的抗氧化能力，作用效果與濃度有關〔11〕。并且MT3可通過減少SAMP8小鼠海馬Bax表達和增加Bcl-2表達，減少細胞凋亡，保護海馬神經元組織結構〔12〕。

1 Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model of senile dementia:pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998;78:399-404.

2 Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20(2):111-5.

3 Han S，Rudd JA，Hu ZY，et al.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010;120(9):602-8.

4 Fernández-Gómez FJ，Mu?oz-Delgado E，Montenegro MF，et al.Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(1):155-66.

5 張均田，石成璋，梅堡幸，等.“水迷宮”自動控制儀的研制及在神經藥理研究中的應用〔J〕.藥理分析雜志，1991;11(1):23-6.

6 Uchida Y，Takio K，Titani K.The growth inhibitory factor that is deficient in Alzhemler’sdisease is a 68 amino acid metallothionein-like protein〔J〕.Neuron，1991;7(2):337-47.

7 Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，et al.Metallothionein is reduced in Alzheimer’s disease〔J〕.Brain Res，2001;894:37-45.

8 Takeda T.Senescence-accelerated mouse(SAM):a biogerontological resource in aging research〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20(2):105-10.

9 Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model of senile dementia:pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998;78:399-404.

10 劉一凡，石學敏，韓景獻，等.快速老化腦萎縮模型小鼠腦抗氧化酶活性增齡性變化的研究〔J〕.中國老年學雜志，2003;23(7):462-3.

11 馬飛煜，張 昱，何 雨，等.金屬硫蛋白對快速老化癡呆小鼠海馬抗氧化損傷作用的研究〔J〕.中風與神經疾病雜志，2007;24(1):59-60.

12 馬飛煜，王 鳳，王 虎，等.金屬硫蛋白3對快速老化癡呆模型小鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡的影響.〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(12):1503-5.