拉曼光譜在乳腺癌相關研究中的應用

王心莉 韓 冰 路 璐 吳 迪 杜 燁 范志民 鄭 超 張海鵬

(吉林大學第一醫院乳腺外科，吉林 長春 130021)

拉曼光譜分析技術是以拉曼效應為基礎建立起來的分子結構表征技術。由于拉曼光譜具有操作簡便、測定時間短、靈敏度高、無損傷等優點，使其在醫學領域研究中得到廣泛應用。最近，由于拉曼光譜儀器的改良和數學方法在結果分析中的應用，使拉曼光譜在腫瘤診斷及發生機制研究方面顯示出突出優勢，成為新的研究熱點。

1 拉曼光譜在乳腺癌中的研究基礎

1.1乳腺微鈣化的拉曼光譜研究 早期的拉曼光譜應用于乳腺癌診斷，主要針對于鈣化灶成分的鑒別。乳腺癌的鈣化主要分為兩類，以草酸鈣為主要成分的鈣化；磷酸鈣和碳酸鈣，以羥磷灰石為主要成分。草酸鈣最常見于乳腺良性疾病，較少見于乳腺癌，而磷酸鈣主要見于增生性疾病中，包括乳腺良、惡性疾病，但良性疾病形成的鈣化除了主要成分羥磷灰石以外含有比惡性鈣化更多的碳酸鹽，相比之下惡性鈣化成分更純，主要是羥磷灰石，而且惡性病變的鈣化往往還有更多的蛋白質。

Haka等〔1〕應用拉曼光譜對含有微鈣化灶的人乳腺病灶石蠟切片標本進行研究，檢測證實乳腺囊性增生導致的鈣化是典型的Ⅰ型鈣化，拉曼光譜峰值在912/cm，1 477/cm和1 632/cm；伴有導管癌的Ⅱ型鈣化拉曼光譜檢測發現并非純羥磷灰石(960/cm，948/cm，1 028/cm和1 061/cm，1 075/cm)還包含有蛋白質(1 445/cm，1 650/cm)、苯丙氨酸(1 004/cm)和脂質(1 130/cm，1 300/cm)，最為重要的是在960/cm峰增寬表明其中含有碳酸鈣。并且，該小組將主成分分析(PCA)與Logistic回歸相結合分析以Ⅱ型鈣化，結果該方法的敏感性和特異性分別是88%和93%。但是實驗采用的是石蠟固定后的組織，而非新鮮組織。固定后標本與新鮮標本不同，這種固定后的標本拉曼光譜檢測干擾較多，不利于結果分析。

Saha等〔2〕采用便攜式拉曼光譜檢測159例新鮮乳腺穿刺活檢組織，其中組織中的Ⅰ類鈣化即草酸鈣的峰值位于912和1 477/cm，Ⅱ類鈣化即羥磷灰石的峰值主要位于960/cm；并且在約2 150 μm深處的新鮮乳腺組織中檢測到了微鈣化。同時根據提供組織形態學信息和化學組成的特征峰的出現與否建立了適合系數(FC)模型，并計算出這個模型對于不同組織的變異系數，其中正常乳腺組織的變異系數為0.03，不伴有微鈣化的乳腺病變組織為0.12，伴有微鈣化的為0.22。

1.2單個細胞的研究 針對單個細胞的研究所對應的光譜較乳腺組織檢測結果相對簡單，便于分析，對構成細胞的3個主要成分核酸、蛋白質和脂肪光譜學改變有一定認識。

研究發現乳腺癌細胞DNA的磷酸骨架峰782、810/cm完全消失，1 084/cm的譜線明顯減少和脫氧核糖-磷酸振動峰1 155及1 262/cm拉曼譜線也明顯減少，表征DNA構象的特征峰812/cm及譜線979 668/cm消失，并有新峰1 175/cm出現，905/cm的譜線增強并有6/cm的紅移，可能說明DNA的磷酸根骨架有一定的斷裂，導致癌細胞的分裂繁殖失去有效的控制〔3〕。Yu等〔4〕測試了正常細胞和乳腺癌細胞中DNA的拉曼光譜，發現乳腺癌細胞的DNA擬合系數高于正常細胞，而RNA的擬合系數則無明顯變化。Zoladek等〔5〕通過共聚焦顯微拉曼光譜儀分析了人乳腺癌(MDA-MB-231)細胞在細胞凋亡過程中最初6 h的時間進程光譜圖像，結果表明由于DNA縮合在凋亡細胞中DNA拉曼光譜帶信號強度增強；將來這種技術可能會成為體外毒理學研究和測試新藥物的一種工具。蛋白質在正常乳腺細胞和癌細胞中的拉曼光譜特征還存在爭議。有人認為癌細胞與正常細胞在1 658、1 300、1 262、1 002和852/cm的拉曼譜線沒有多大區別，可能說明癌細胞中的蛋白質在結構上并沒有發生明顯的改變。但謝裕安等〔6〕測量人正常上皮乳腺細胞株(HBL-100)和乳腺癌細胞株(MCF-7)的單細胞拉曼光譜時則得出與之不同的結果，該結果表明乳腺癌細胞的譜線強度整體變強，乳腺癌細胞的光譜中蛋白質的歸屬峰936、1 002和1 445/cm及脂類的歸屬峰1 298/cm的峰高比正常乳腺細胞的升高。

另外在針對單個細胞的研究中，乳腺癌細胞的特征性受體(Her-2)也有研究報道。Hartsuiker等〔7〕采用共焦顯微拉曼光譜成像技術檢測化學成分單一的MDA-MB-231，MDA-MB-435s及SK-BR-3乳腺癌細胞系，發現與Her-2表達陽性的SK-BR-3細胞相比，Her-2表達陰性的MDA-MB-231細胞中脂類含量增加而飽和脂肪酸含量降低；同時，在MDA-MB這類具有高度轉移性的細胞系中，多不飽和脂肪酸的含量增加。Yang等〔8〕利用p-對巰基苯甲酸介導的抗Her-2抗體共軛銀納米粒子作為表面增強拉曼的探針來檢測Her-2陽性乳腺癌SKBR3細胞株及Her-2陰性乳腺癌MCF7細胞株。實驗結果顯示，SKBR3細胞表現出比MCF7細胞更強大的SERS信號，表明該探針可能會用來區分不同乳腺癌細胞的HER2狀態。這種SERS探針制作簡單、檢測迅速、且具有高SERS敏感性和生物相容性，可以避免傳統免疫組織化學和熒光原位雜交兩種檢測方法費用巨大時間持久的缺點，而且有可能直接檢測活體細胞或組織。

1.3針對血清的拉曼光譜研究 很多研究試圖通過檢測乳腺癌患者血清來診斷乳腺癌。正常人血清在固定波長的激發強度與癌癥患者有差異〔9〕，還有研究發現在某些特定波數癌癥患者與正常人有差異〔10〕，但僅僅是差異觀察尚不足以證明這種差異。Piehardo-Molina〔11〕、郭麗等〔12〕通過測試11例乳腺癌和12例健康人血清的拉曼光譜，并用主成分分析PCA和線性判別分析LDA方法研究了實驗組與對照組的拉曼光譜，發現PCA可以使在不同的波段找出對照組和實驗組的差別，可能說明血清的拉曼光譜檢測可以用于診斷乳腺癌。

1.4乳腺組織切片的拉曼光譜研究 對于診斷乳腺癌，主要研究對象還是病變組織。最容易獲得的標本是石蠟和冰凍切片，研究早期相關報道較多。姚淑霞等〔13〕采用激光共焦顯微拉曼光譜議對乳腺癌的病理切片及乳腺良性腫瘤的病理切片進行研究，發現細胞核上的拉曼峰較其他位置明顯，癌變組織860/cm處的拉曼峰明顯藍移；1 610/cm處的峰值與1 525/cm處的峰值比反映了病變與正常乳腺組織之間光譜的差異，并提出了以1 610/cm/1 525/cm是否>1.015作為判斷乳腺組織是否癌變的標準。但是這種組織切片由于經過了處理，對拉曼光譜結果有很大影響。馮春霞等〔14〕對40例新鮮腫瘤組織及腫瘤組織冰凍切片的拉曼光譜進行對比分析發現，激發光源、樣品形態、切片厚度、離體時間、保存條件等因素對腫瘤組織拉曼光譜的采集會造成一定的影響。只有選擇合理的參數設置和處理方法，才可能獲得理想的拉曼光譜。Faolain等〔15〕比較全面地研究了冰凍、甲醛固定、石蠟包埋和脫蠟對組織拉曼光譜的影響，發現由于冰凍和甲醛固定而出現了新峰，同時氨基化合物波段出現了漂移。因此，采用新鮮組織的研究逐漸取代了對于組織切片的研究。

2 拉曼光譜的臨床研究

2.1手術切緣陽性檢測 Haka等〔16〕首次將拉曼光譜儀用于體內乳腺組織的拉曼光譜收集，從9例接受部分乳房切除手術的患者乳腺組織殘腔內的切緣表面收集了30個拉曼光譜，運用先前體外實驗所建立的拉曼診斷模型計算這些拉曼光譜并與病理學結果相比較，該拉曼診斷模型結果的總體準確率為93%(28/30)。該實驗初步表明了用拉曼光譜評估術中乳腺切緣的可行性。

Keller等〔17〕設計了一個具有多重偏移探測器的空間位移拉曼光譜探針用來檢測35例新鮮冰凍乳腺組織樣品，其中13例沒有腫瘤組織樣品及2例含有腫瘤但是腫瘤距離所測量樣品表面的最近距離>2 mm的組織樣品被標記為“陰性切緣”；其他15例含有乳腺浸潤性導管癥(IDC)及5例含有乳腺浸潤性小葉癌(ILC)的組織樣品(腫瘤距離所測量樣品表面的最近距離<2 mm)被標記為“陽性切緣”。由每個探測器所檢測的平均光譜創建出一個復合譜，這個復合譜含有組織表面到組織表面下2 mm內所有的生化信息。采用稀疏多項式邏輯回歸分析方法將這些復合譜區分為陽性或陰性，然后與這些組織的病理學結果相比較而得出該方法的靈敏度為95%、特異度為100%。到目前為止，國內外文獻尚沒有對取樣速度、樣品體積等與實驗方法密切相關的方面的闡述，同時診斷的準確性也需要大量的臨床病例證實。

2.2乳腺腋窩淋巴結的拉曼光譜研究 拉曼光譜研究淋巴結轉移主要是希望將其應用于前哨淋巴結活檢。Horsnell等〔18〕采用拉曼光譜檢測38例IDC患者的腋窩淋巴結狀態，所檢測的數據用PCA方法分析后與病理學結果比較，結果表明該方法在鑒別正常與轉移性淋巴結時，其靈敏度高達92%，特異性為100%。Sattlecker等〔19〕詳細分析了拉曼光譜與多元統計分析方法相結合來評估乳腺癌患者腋窩淋巴結狀態的準確性，采用拉曼光譜檢測43例乳腺癌患者的腋窩淋巴結，所獲得的拉曼光譜數據集來構建不同類型的支持向量機(SVM)模型，包括線性、多項式和徑向基函數(RBF)，并與傳統的化學計量學方法：線性判別分析(LDA)模型和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型相對比，結果表明RBF-SVM模型具有高達100%的分類精度，顯示了其在應用于臨床診斷方面的巨大潛力。

拉曼成像技術〔20〕最早用來評估前哨淋巴結狀態并區分其陰陽性時被證實具有91%的靈敏度和93%的特異性。陽性及陰性淋巴結組各平均光譜分析結果表明，與陰性淋巴結相比，陽性淋巴結的DNA及酪氨酸波峰增強而膠原蛋白波峰降低。然而為了精確的測量繪制該拉曼圖像，需要12～120 h的測量以獲得足夠數量的拉曼光譜，這一缺點限制了拉曼成像技術在術中的應用。Horsnell等〔21〕設計了一個探測器模型以較少的拉曼特征光譜評估淋巴結狀態，從而實現在期限時間內快速診斷。實驗結果表明該拉曼檢測系統用于臨床術中評估腋窩淋巴結狀態的可行性。

3 參考文獻

1Haka AS, Shafer-Peltier KE, Fitzmaurice M,etal. Identifying microcalcifications in benign and malignant breast lesions by probing differences in their chemical composition using Raman spectroscopy 〔J〕. Cancer Res, 2002;62(18): 5375-80.

2Saha A, Barman I, Dingari NC,etal. Raman spectroscopy: a real-time tool for identifying microcalcifications during stereotactic breast core needle biopsies 〔J〕. Biomed Opt Express, 2011; 2(10): 2792-803.

3閆循領, 董瑞新, 王秋國, 等. 乳腺癌病人單個細胞的Raman光譜 〔J〕. 光譜學與光譜分析, 2005;(1): 58-61.

4Yu C, Gestl E, Eckert K,etal. Characterization of human breast epithelial cells by confocal Raman microspectroscopy 〔J〕. Cancer Detect Prev, 2006;30(6): 515-22.

5Zoladek A, Pascut FC, Patel P,etal. Non-invasive time-course imaging of apoptotic cells by confocal Raman micro-spectroscopy 〔J〕. J Raman Spectroscopy, 2011; 42(3): 251-8.

6謝裕安, 冷朝輝, 孟令晶, 等. 乳腺上皮細胞與癌細胞的激光鑷子拉曼光譜研究 〔J〕. 中華腫瘤防治雜志, 2010; 14(20): 1605-8.

7Hartsuiker L, Zeijen NJ, Terstappen LW,etal. A comparison of breast cancer tumor cells with varying expression of the Her2/neu receptor by Raman microspectroscopic imaging 〔J〕. Analyst,2010;135(12):3220-6.

8Yang J, Wang Z, Zong S,etal. Distinguishing breast cancer cells using surface-enhanced Raman scattering 〔J〕. Anal Bioanal Chem, 2012; 402(3):1093-100.

9高澤紅, 丁建華, 林鈞岫, 等. 人體血清可見拉曼光譜與DNA紫外共振拉曼光譜的檢測 〔J〕. 中國激光醫學雜志, 1999;8(4):207.

10趙萬利, 張 毅, 李 睿, 等. 拉曼光譜快速診斷惡性腫瘤研究 〔J〕. 激光雜志, 2008;3:72-3.

11Pichardo-Molina JL, Frausto-Reyes C, Barbosa-Garcia O,etal. Raman spectroscopy and multivariate analysis of serum samples from breast cancer patients 〔J〕. Lasers Med Sci,2007;22(4):229-36.

12郭 麗, 張 毅, 呂金燕, 等. 用多元分析方法研究乳腺癌血清的表面增強拉曼光譜 〔J〕. 光譜學與光譜分析, 2013;(6):1553-6.

13姚淑霞, 趙元黎, 張 錄, 等. 乳腺組織切片的拉曼光譜的研究 〔J〕. 河南預防醫學雜志, 2004;5(3):132-4.

14馮春霞, 羅榮輝, 郭茂田, 等. 腫瘤拉曼光譜檢測的影響因素分析 〔J〕. 激光雜志, 2008;15(3):74-5.

15Faolain EO, Hunter MB, Byrne JM,etal. A study examining the effects of tissue processing on human tissue sections using vibrational spectroscopy 〔J〕. Vibrational Spectroscopy, 2005;38(1-2):121-7.

16Haka AS, Volynskaya Z, Gardecki JA,etal. In vivo margin assessment during partial mastectomy breast surgery using Raman spectroscopy 〔J〕. Cancer Res, 2006; 66(6): 3317-22.

17Keller MD, Vargis E, de Matos Granja N,etal. Development of a spatially offset Raman spectroscopy probe for breast tumor surgical margin evaluation 〔J〕. J Biomed Opt, 2011;16(7): 077006.

18Horsnell J, Stonelake P, Christie-Brown J,etal. Raman spectroscopy—a new method for the intra-operative assessment of axillary lymph nodes 〔J〕. Analyst, 2010;135(12):3042-7.

19Sattlecker M, Bessant C, Smith J,etal. Investigation of support vector machines and Raman spectroscopy for lymph node diagnostics 〔J〕. Analyst, 2010;135(5): 895-901.

20Smith J, Kendall C, Sammon AM,etal. Raman spectroscopy is sensitive and specific in the detection of lymph node metastases in breast cancer; proceedings of the diagnostic optical spectroscopy in biomedicineⅢ, munich,germany, f 2005/06/12, 2005 〔C〕. Optical Society of America.

21Horsnell JD, Smith JA, Sattlecker M,etal. Raman spectroscopy—a potential new method for the intra-operative assessment of axillary lymph nodes 〔J〕. Surgeon, 2012;10(3):123-7.