肉桂酰胺格爾德霉素增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)力達(dá)霉素敏感度的研究

李 良 韓菲菲 甄永蘇

力達(dá)霉素(lidamycin，LDM)是利用精原細(xì)胞法從我國湖北省潛江縣土壤中分離的鏈霉菌Streptomyces globisporus C-1027中篩選得到的一種烯二炔類抗生素，全部分子結(jié)構(gòu)由1個(gè)110個(gè)氨基酸的酸性輔基蛋白(MW 10．5kDa)和1個(gè)含有九元環(huán)烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(MW 843Da)通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成［1，2］。LDM具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其主要機(jī)制是引起DNA分子斷裂、損傷，LDM與細(xì)胞DNA分子結(jié)合后，經(jīng)伯格曼環(huán)化反應(yīng)生成雙自由基中間體，所產(chǎn)生的自由基奪取核苷酸核糖骨架的氫原子進(jìn)而引起細(xì)胞DNA斷裂［3，4］。LDM對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都具有明顯的體內(nèi)、體外抗腫瘤活性，其細(xì)胞水平的IC50值均為納摩爾水平，因此是研制新型高效抗腫瘤藥物的理想候選藥物。

肉桂酰胺格爾德霉素［17-(6-cinnamamidohexylamino-)-17-demethoxygeldanamycin，CNDG］是本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中合成的具有肉桂酰胺結(jié)構(gòu)的格爾德霉素衍生物，其作用靶點(diǎn)是熱休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)。HSP90是一種有管家基因表達(dá)的的分子伴侶蛋白，主要功能維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的形成［5］。HSP90在許多腫瘤中都存在過表達(dá)的現(xiàn)象，而且許多與腫瘤細(xì)胞分化、增生、侵襲密切相關(guān)的靶點(diǎn)分子均受HSP90調(diào)控，如BCRABL、EGFR、Her-2 等［6～9］。目前，正處于臨床研究階段的 HSP90抑制劑主要包括 17-AAG、17-DMAG、IPI-504 和 SNX2112 等［10，11］。近來有研究報(bào)道，HSP90抑制劑有增強(qiáng)化療藥物尤其是DNA損傷藥物抗腫瘤活性的作用，這一作用可能與DNA損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子受HSP90調(diào)控有關(guān)［12］。本研究擬利用HSP90抑制劑CNDG與LDM聯(lián)合應(yīng)用，抑制LDM引起DNA斷裂后所激活的DNA損傷修復(fù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

材料與方法

1．試劑與細(xì)胞株:力達(dá)霉素與肉桂酰胺格爾德霉素由本實(shí)驗(yàn)室制備。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人肺癌細(xì)胞A549有實(shí)驗(yàn)室保存。MTT購自美國Sigma公司，ECL發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司，細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司、所有抗體均為Cellsignal公司產(chǎn)品。

2．方法:(1)MTT法測(cè)定CNDG聯(lián)合LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4000～5000/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24h后加入不同濃度的藥物處理(LDM(0．05、0．1nmol/L)，CNDG(0．5、1、5μmol/L))，設(shè)至少 3 個(gè)平行孔。48h后向每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃溫育4h。吸出上清液，加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度(A)值。將各測(cè)試孔的A值減去本底A值，各平行孔的A值取平均數(shù)。細(xì)胞的存活率以T/C(%)表示，T為加藥組細(xì)胞的A值，C為對(duì)照組細(xì)胞的A值。細(xì)胞存活率(%)=(T-本底A值)/(C-本底A值)×100%。兩藥聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)=Vcomb/(VLDM×VCNDG)，Vcomb為聯(lián)合給藥組 T/C 比值，VLDM、VCNDG為單藥組T/C比值。CI＜1表示有協(xié)同作用，CI=1表示有相加作用，CI＞1表示有拮抗作用。(2)CNDG聯(lián)合LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響:接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，CNDG聯(lián)合LDM藥物處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，1000r/min 4℃離心10min。重懸細(xì)胞，乙醇4℃固定。PI染色前，細(xì)胞用PBS洗兩遍，然后重懸于PI染液中，37℃避光染色30min。細(xì)胞經(jīng)過濾后用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量并分析細(xì)胞周期分布。(3)Western blot法檢測(cè)CNDG聯(lián)合LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞ATRIP、c-PARP水平的影響:取藥物處理后細(xì)胞株，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求在不同時(shí)間收集培養(yǎng)細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳后取出凝膠，轉(zhuǎn)PVDF膜。1%BSA封閉2h，加入1∶1000稀釋的一抗，室溫孵育2～3h，TBST洗膜3次;加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2～3h，TBST洗膜6次。以ECL試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)照相并保存分析結(jié)果。(4)免疫熒光檢測(cè)CNDG聯(lián)合LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞γH2AX水平的影響:在不同時(shí)間用藥物處理細(xì)胞，LDM和CNDG單獨(dú)或聯(lián)合處理;細(xì)胞經(jīng)藥物處理后用4%多聚甲醛固定30min，用PBS洗3次，0．1%NP-40 PBS-T打孔30min，1%BSA封閉1h，一抗孵育4℃過夜，用PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記的二抗37℃避光孵育1h，Hochest33258復(fù)染，50%甘油-PBS封片以防熒光淬滅，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

結(jié) 果

1．CNDG增強(qiáng)LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞增生抑制作用:MTT法檢測(cè)CNDG與LDM聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人乳腺癌MCF-7、人肝癌Bel-7402、人肺癌A549細(xì)胞增生的影響，并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)。結(jié)果表明，CNDG 1、5μmol/L能明顯增強(qiáng)LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞增生抑制作用，CNDG與LDM 0．05nmol/L聯(lián)合給藥對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的CI值＜1，顯示協(xié)同作用(圖1)。

2．CNDG改變LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用:LDM給藥24h作用后對(duì)腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯顯著，MCF-7細(xì)胞從3．14%升高至47．76%，加入CNDG后G2/M期從47．76%下降到30．28%，G1期細(xì)胞增加。Bel-7402細(xì)胞從80．61%下降到60．43%。A549細(xì)胞從24．86%下降到8．29%(圖2)。

3．CNDG與LDM聯(lián)合影響腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子蛋白水平:Western blot法檢測(cè)與凋亡相關(guān)的PARP的切割水平，LDM與CNDG兩藥單藥PARP的切割水平變化不明顯，兩種藥物聯(lián)合PARP切割水平顯著提高。另外，LDM單藥可增加MCF-7細(xì)胞ATRIP的水平，與CNDG聯(lián)合應(yīng)用使ATRIP蛋白水平顯著下降(圖3)。

4．CNDG與LDM聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞γH2AX的影響:γH2AX是細(xì)胞DNA損傷后可迅速聚集于細(xì)胞核DNA損傷部位的蛋白因子，其磷酸化水平反應(yīng)細(xì)胞DNA損傷程度。γH2AX常用來表示DNA雙鏈斷裂程度。用免疫熒光的方法檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)過CNDG和LDM處理后細(xì)胞內(nèi)γH2AX水平以測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂水平，LDM給藥1h后γH2AX陽性的細(xì)胞比例升高，經(jīng)CNDG預(yù)處理的細(xì)胞γH2AX的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明DNA雙鏈斷裂水平增加(圖4)。

討 論

LDM屬于九元環(huán)烯二炔類抗生素，具有高效細(xì)胞毒活性，其體內(nèi)、體外抗腫瘤活性明顯。這些作用均源于LDM與細(xì)胞DNA結(jié)合后自由基對(duì)DNA的斷裂作用。腫瘤細(xì)胞經(jīng)放療、化療等作用于DNA的治療方式后可引起DNA損傷后修復(fù)，而這一過程可能會(huì)引起腫瘤細(xì)胞耐藥。因此尋找靶向DNA損傷修復(fù)的藥物是對(duì)抗腫瘤細(xì)胞耐藥、增敏化療藥物的有效策略。DNA損傷后修復(fù)是細(xì)胞DNA受損后的自發(fā)反應(yīng)，其中ATM/ATR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮重要作用，ATM和ATR通過對(duì)下游信號(hào)分子的一系列磷酸化觸發(fā)DNA修復(fù)［13］。作用于 DNA的藥物通過 ATM、ATR等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使腫瘤產(chǎn)生G2/M期阻滯，在此阻滯期細(xì)胞對(duì)受損DNA進(jìn)行修復(fù)。這一機(jī)制對(duì)細(xì)胞的存活有重要的意義，低劑量DNA損傷藥物或低劑量射線作用下，細(xì)胞可以通過這種修復(fù)的方式順利的存活，當(dāng)DNA損傷程度超出修復(fù)能力或修復(fù)機(jī)制受到干擾時(shí)會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［14］。本研究選擇了前期工作中得到的HSP90抑制劑CNDG作為L(zhǎng)DM的增敏劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LDM與HSP90抑制劑的聯(lián)合給藥大大增強(qiáng)了腫瘤殺傷作用，腫瘤細(xì)胞PARP的切割水平明顯提高，達(dá)到了顯著地協(xié)同作用。

圖1 CNDG與LDM聯(lián)合給藥對(duì)MCF-7、Bel-7402、A549腫瘤細(xì)胞增生抑制作用

圖2 CNDG聯(lián)合LDM影響腫瘤細(xì)胞周期

圖3 CNDG與LDM聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)c-PARP和ATRIP的影響

圖4 用γH2AX分析A549細(xì)胞對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)水平

在分子水平上，LDM單藥組γH2AX的水平降低，雙鏈斷裂較少，而CNDG預(yù)處理組的γH2AX則顯著增加，這一結(jié)果表明CNDG可以增強(qiáng)力達(dá)霉素對(duì)DNA的雙鏈斷裂作用。有研究報(bào)道，細(xì)胞接觸LDM后即會(huì)同時(shí)激活A(yù)TM、ATR兩條通路，與其他藥物作用機(jī)制略有不同，LDM對(duì)兩條通路可同時(shí)激活，且沒有優(yōu)先次序［15］。因此，只要二者之一激活的情況下即可誘導(dǎo)DNA的損傷后的細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)。單獨(dú)抑制ATM或ATR通路并不能有效抑制腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)。而CNDG可能通過抑制HSP90的活性進(jìn)而抑制ATM/ATR兩條通路以降低DNA的損傷后修復(fù)能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)LDM的敏感度，因?yàn)锳TM、ATR的活性均受 HSP90調(diào)控。ATRIP在DNA損傷后修復(fù)應(yīng)答過程中同樣具有重要作用，ATR發(fā)揮功能需要與ATRIP形成復(fù)合物。在本研究中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)CNDG處理后，ATRIP的水平顯著下降，CNDG可以降低ATRIP的總蛋白水平，從而影響ATR通路的活性，降低了LDM作用后腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明HSP90抑制劑CNDG能夠明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)烯二炔類抗生素LDM的敏感度，作用機(jī)制可能與HSP90被抑制后DNA損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子蛋白水平及生物活性降低有關(guān)。同時(shí)針對(duì)DNA損傷修復(fù)機(jī)制研究新型抗腫瘤藥物有可能是一種有效的抗腫瘤藥物研究策略。

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