鈣蛋白酶與心血管疾病

葉婷婷 魏 盟

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的病死率逐漸增高，并成為全球關注的健康問題。鈣蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員。生理狀態下，calpain參與多種鈣離子調控的細胞程序，如信號轉導，細胞增殖、分化、凋亡、細胞膜融合和血小板激活。在病理狀態時，鈣蛋白酶活性異常增強，參與了老年癡呆癥、肌肉營養不良、缺血和外傷性腦損傷、癌癥、白內障、休克、糖尿病等許多病變［1］。在心血管疾病中，鈣蛋白酶被過度激活后參與了心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、糖尿病心肌病、高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發生、發展。本文對鈣蛋白酶在心血管疾病中的作用做一綜述。

一、calpain的結構及激活機制

calpain是由Gordon Guroff等在1964年首次發現的［2，3］。在人類基因組中，有15種基因 Capnn(n=1，2，3，5～16)編碼鈣蛋白酶的同工酶，各種同工酶有不同的組織分布和功能。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2在心血管疾病中發揮著重要功能，都是由80kDa(由Capn1和Capn2基因分別編碼)的催化亞基和30kDa(由Capn4基因編碼)的調節亞基組成。根據結構，催化亞基分為4個(Ⅰ～Ⅳ)結構域，調節亞基分為2個(Ⅴ～Ⅵ)結構域。結構域Ⅰ和Ⅱ是蛋白酶核心，包含了催化三聯體的殘基:該活性位點的半胱氨酸在結構域Ⅰ，組氨酸/天冬酰胺對在結構域Ⅱ。結構域Ⅲ包含兩個Ca2+連接位點和1個磷脂結合結構，其中的C 2-樣結構域被認為是通過特殊的靜電作用參與底物識別來調節鈣蛋白酶活性。結構域Ⅳ有5個“EF手型”(EF hand)結構，前4個“EF-手型”結構含有Ca2+結合位點，第5個“EF-手型”結構參與鈣蛋白酶的大、小亞基組成異質二聚體。結構域Ⅴ包含參加疏水性的甘氨酸殘留物簇，可能與膜的吸附有關。結構域Ⅵ和Ⅳ的“EF-手型”結構相互作用形成異質二聚體，使大、小亞基連接在一起［4，5］。

calpain1和2通常以無活性的形式存在于細胞質中，細胞內Ca2+水平增加后激活轉位至細胞膜。calpain通過Ca2+激活的調節機制包括兩個階段。第1階段:結構域的相互作用引起構象改變。Ca2+和磷脂質連接到鈣蛋白酶，引起30kDa的亞基從80kDa的分離。結構域Ⅰ的自溶水解在激活期間發生。第2階段:重排催化活性中心。通過結合兩個鈣離子到Ⅱa和Ⅱb結構子域，使Ⅱa和Ⅱb靠近在一起，形成一個功能性催化中心。第2個階段的發生僅僅在第1階段構象改變后引起。另外，研究發現calpain1在體外的激活不要求自溶或亞基解離［3，4，6，7］。

二、calpain與心血管疾病

1．calpain與心肌缺血/再灌注損傷:心肌持續性缺血導致組織損傷和細胞死亡，早期再灌注能夠減輕心肌缺血的損傷程度，但是缺血的心肌在血管開放后會導致嚴重的心律失常，心肌壞死面積擴大，心臟破裂甚至死亡。研究發現，在缺血再灌注心肌損傷過程中，心肌細胞內氧自由基增加、鈉鉀ATP酶激活、Ca2+濃度異常升高，從而引起線粒體 calpain1激活［8］。激活的calpain1將AIF分裂成t-AIF，隨后轉移到細胞核并通過激活多聚ADP核糖聚合酶而增加非caspase依賴的細胞凋亡。另外，在缺血再灌注過程中，線粒體中calpain1的激活增加的凋亡誘導因子的分裂，細胞中凋亡誘導因子的減少增加了心臟損傷［9］。以上兩個過程都可以被 MDL-28170阻止［10］。Chen等［11］在30min缺血和2h再灌注鼠和兔模型中發現，再灌注引起鈣蛋白酶的激活，導致Bid(BH3家族的唯一成員)的分裂，進而Bid調節細胞色素C的釋放能力喪失。細胞色素C的缺失導致線粒體無法執行氧化磷酸化并且增加活性氧產量。最后，與線粒體功能障礙有關的通透性轉換孔不可逆地開放，這種開放與細胞死亡密切相關。

2．calpain與高血壓:高血壓會引起血管內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增生、基質沉積，繼而引起血管壁增厚和管腔狹窄。Letavernier等［12］制作了高表達鈣蛋白酶抑制蛋白的轉基因鼠模型，并將血管緊張肽Ⅱ緩慢注入該轉基因小鼠和野生小鼠體內誘導高血壓。4周以后在野生小鼠心臟和腎皮質內NF-κB的活性大大增加。相比之下轉基因小鼠上述表現明顯減少。calpain已被證明參與NF-κB的激活過程，并認為鈣蛋白酶抑制蛋白可能通過減少NF-κB的激活，降低基質金屬蛋白酶(MMP)活性或減少膠原纖維的沉淀來阻止血管的重構。Jiang等［13］在體外培養血管平滑肌細胞，發現過表達calpain1能夠誘導轉化生長因子-β1/Smad信號，引起彈性蛋白降解、堿性磷酸酶激活，降低鈣化抑制劑、骨橋蛋白和骨連接素的表達。另外，MMP和calpain的激活能夠引起膠原Ⅰ和Ⅲ的沉積、血管壁的鈣化。Sedding等［14］將血管平滑肌細胞暴露于體外周期性拉伸力，發現機械應力能使calpain活性增加。通過鈣蛋白酶抑制蛋白或反義寡核苷酸阻止calpain激活可以增加張力誘導的P53表達和轉錄活性，導致細胞凋亡率的進一步增加。calpain通過P53降解特性中和了平滑肌細胞過度凋亡，證明calpain是血管壁機械敏感度重構過程的關鍵調節者。

3．calpain與心力衰竭:各種心臟疾病都能引起心力衰竭(HF)，從而使心排出量不能滿足機體的需求，產生一系列癥狀和體征。Yang等［15］對39例充血性心力衰竭患者和38例健康對照組進行了比較，發現在充血性心力衰竭患者的血漿和心臟中血管緊張肽Ⅱ顯著增加，與心室重構指數緊密相關。另外，心力衰竭的心室組織中calpain顯著上調，cain/cabin1的分裂增加，CaN激活。Takahashi等［16］將鼠左冠狀動脈結扎，第2周和第8周鼠左心室肌和右心室肌都出現了m-calpain的表達增高，并且在第8周后，血流動力學發生改變并顯現慢性心力衰竭的癥狀。若從第2周起，口服3mg/(kg·d)群多普利或1mg/(kg·d)坎地沙坦至第8周，血流動力學改善。服藥的鼠第8周時mu-calpain和m-calpain都減少，右心室calpastatin含量增加，表明calpain參與了慢性心力衰竭的發展，群多普利和坎地沙坦能夠抑制calpains的激活，保護心肌梗死后的心肌。Ahmad等［17］在4h右心室壓力超負荷誘導右心力衰竭豬模型中發現，右心力衰竭與焦點黏附蛋白 talin有關，使用MDL-28170抑制calpain能夠改善右心室功能失調、保護右心室talin。說明鈣蛋白酶抑制可能為臨床治療急性肺心病提供新方法。

4．calpain與糖尿病心肌病:近年，隨著糖尿病發生率的增高，由糖尿病引起的心臟微血管病變和心肌代謝紊亂受到了人們的關注。Bajaj等研究了半胱氨酸蛋白酶家族的兩個成員caspases和calpains在細胞凋亡中的作用，發現在心肌細胞中，calpain1在腫瘤壞死因子-α引起的細胞凋亡中激活caspase3和多聚ADP核糖聚合酶，并且calpain1在鈣離子超負荷后分裂細胞凋亡誘導因子［18］。研究表明，Capn4基因的敲除減少了糖尿病心臟中腫瘤壞死因子-α和轉化生長因子 -β1的表達［19，20］。Jian等發現心肌細胞特性Rac1的缺失或使用Rac1蛋白抑制劑能夠使糖尿病心肌梗死后心肌功能恢復的能力提高。Rac1信號途徑的中斷阻止了NADPH氧化應激和活性氧(ROS)的產生，從而抑制calpain的激活。此外，通過SOD2超表達抑制線粒體ROS或通過鈣蛋白抑素超表達抑制calpain活性能夠使糖尿病心肌梗死損傷減少。Li等［19］在STZ誘發糖尿病鼠模型中，證明calpain的激活能夠引起I κB的降解和NF-κB的激活，NF-κB轉錄到細胞核并轉錄促肥厚基因如β-MHC，calpain也能激活磷酸酶(calcineurin)，引起心肌肥厚。研究顯示，NF-κB與心肌纖維化、炎癥有關。通過生理性鈣蛋白酶抑制劑、鈣蛋白酶-1小干擾RNA或鈣蛋白酶抑素的超表達，能阻礙高糖誘導的心肌細胞或高糖心臟的細胞凋亡。

5．calpain與心肌梗死:冠狀動脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴重的持久性缺血而發生壞死。可發生律失常、休克或心力衰竭。Mani等將小鼠分為兩組，實驗組靜脈內給予0．5mg/kg體重calpeptin，相同劑量每天皮下注射1次。對照組不予處理。4天后將實驗組、對照組制作心肌梗死模型。發現calpeptin處理組左心射血分數(EF)顯著改善、舒張末期容積(EDV)較未處理組顯著增加。此外，calpeptin能夠減少calpain和caspase的生成，抑制心肌梗死后心肌重構和功能障礙。研究表明，活化的calpain通過降解N-鈣黏蛋白來拆卸閏盤間的細胞-細胞黏附，并由此促進心肌梗死后心室重構。研究發現，心肌細胞特異性基因Capn4的敲除導致calpain-1和calpain-2表達的破壞，也能夠抑制心肌的炎癥和纖維化，并減少心肌梗死后心臟重塑和功能障礙［20］。

三、展 望

綜上所述，calpain的激活在諸多心血管疾病的發生發展中發揮了重要作用，其作用機制主要通過促進心肌細胞凋亡，引起心肌細胞重構，促進血管重構及鈣化等。并且已證實在細胞水平及動物模型上使用鈣蛋白酶抑制劑能對心肌缺血/再灌注及高血壓引起的血管損傷中起到良好的保護作用。但是calpain的病理生理意義及calpain在糖尿病心肌綜合征中的作用仍未被證明。盡管上文中提到的研究沒有進行系統的臨床研究，也沒有證據顯示鈣蛋白酶抑制劑能夠用于治療人類心臟疾病，但是隨著對calpain研究的深入及病理生理作用的進一步闡明，calpain作為心臟疾病的一個潛在靶點將有望在預防和治療心臟疾病方面提供新思路。

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