大黃素對腎纖維化大鼠腎組織MMP－9表達(dá)的影響

李冬梅 劉 巍

（黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，齊齊哈爾 161006）

大黃素對腎纖維化大鼠腎組織MMP－9表達(dá)的影響

李冬梅 劉 巍

（黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，齊齊哈爾 161006）

目的 探討中藥大黃素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）表達(dá)的影響。方法 120只wister大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、梗阻組及大黃素治療組。制備單側(cè)輸尿管梗阻 （UUO）模型。治療組在UUO的基礎(chǔ)上每天以大黃素40mg/kg灌胃，采用病理及免疫組化的方法動態(tài)觀察各組大鼠術(shù)后1d、3d、7d、14d梗阻側(cè)腎臟組織學(xué)變化和MMP－9在梗阻腎小管間質(zhì)中表達(dá)情況。結(jié)果 模型組MMP－9的表達(dá)先增高后降低，治療組MMP－9的表達(dá)水平高于模型組 （P＜0.05）。結(jié)論 中藥大黃素可以通過提高M(jìn)MP－9的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解來發(fā)揮其延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的作用。

腎間質(zhì)纖維化；基質(zhì)金屬蛋白酶－9；大黃素；中藥提純

腎間質(zhì)纖維化 （renal interstitial fibrosis，RIF）是一個進(jìn)行性的過程，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭。細(xì)胞外基質(zhì) （extracellularmatrix，ECM）積聚是腎臟纖維化的最終途徑［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMPs）是調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡的重要酶類。近來研究指出，MMP－2和MMP－9破壞腎小管基底膜，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化［2］。腎纖維化的早期干預(yù)，可以保護(hù)殘存腎功能，修復(fù)損害組織，延緩尿毒癥的發(fā)生［3］。本實驗將探討中藥大黃素對單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠腎間質(zhì)MMP－9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性wister大鼠120只 （齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體重在180～240g。房間保持通風(fēng)、安靜和恒溫，清洗籠具并定期更換墊料。

1.1.2 藥物和試劑 兔抗大鼠多克隆抗體 （MMP－9抗體）購自武漢博士德生物工程有限公司；SP免疫組化試劑盒及顯色底物DAB均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；大黃素購自中國藥檢所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型建立 隨機(jī)分為三個組，即假手術(shù)組、梗阻組 （UUO組）及大黃素治療組，每組均40只大鼠。按參考文獻(xiàn)［4］，梗阻組大鼠行左側(cè)輸尿管近腎盂段結(jié)扎術(shù)建立腎纖維化模型；假手術(shù)組打開腹腔后僅游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎；大黃素治療組在造模成功，動物清醒1h后給予中藥大黃素40mg/kg灌胃，每日一次。分別于術(shù)后1天、3天、7天、14天每組處死10只大鼠，左側(cè)腎臟組織用10%中性甲醛固定24小時，經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，3μm切片，用做HE染色和免疫組化檢測。免疫組化步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.2.2 采用 Meta－Morph/C505BX41醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析 每張切片隨機(jī)選取10個不重疊腎小管間質(zhì)高倍視野，棕黃色顆粒沉積區(qū)域為陽性染色區(qū)，測量棕黃色陽性染色面積占腎小管間質(zhì)總面積的比值，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以 （±s）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗，組間兩兩比較用LSD檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織HE染色光鏡觀察結(jié)果 光鏡下假手術(shù)組各時間點(diǎn)腎小球及腎小管未見異常改變。UUO術(shù)后1天即可見遠(yuǎn)曲小管和集合管略有擴(kuò)張，腎間質(zhì)中偶見炎癥細(xì)胞浸潤；術(shù)后第3天腎間質(zhì)輕度水腫，遠(yuǎn)端小管中度擴(kuò)張，散在炎細(xì)胞浸潤及纖維性滲出；術(shù)后第7天腎間質(zhì)水腫和纖維化加重，腎臟髓質(zhì)充血明顯，更多炎細(xì)胞浸潤，小管上皮細(xì)胞胞漿疏松、腫脹；術(shù)后第14天則出現(xiàn)廣泛性的腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，小管上皮細(xì)胞腫脹及空泡變性明顯，大量炎細(xì)胞浸潤，皮質(zhì)明顯變薄。治療組各時間點(diǎn)腎間質(zhì)的改變與UUO組相比有所減輕，但未達(dá)到假手術(shù)組水平。

2.2 MMP－9免疫組化表達(dá) 假手術(shù)組可見MMP－9在腎小管間質(zhì)及腎小球微量表達(dá)。UUO術(shù)后1天MMP－9在腎小管間質(zhì)表達(dá)僅少量增加，至術(shù)后3天表達(dá)明顯增強(qiáng)，術(shù)后7天表達(dá)達(dá)峰值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢，直至術(shù)后14天本實驗結(jié)束，模型組與假手術(shù)組相比MMP－9陽性面積表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有顯著性 （P＜0.01），提示有統(tǒng)計學(xué)意義。大黃素治療組MMP－9陽性面積表達(dá)與模型組比較明顯增多，差異顯著 （P＜0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組大鼠MMP－9陽性表達(dá)面積占腎小管間質(zhì)總面積 （n＝10，±s）

表1 各組大鼠MMP－9陽性表達(dá)面積占腎小管間質(zhì)總面積 （n＝10，±s）

注：＊為與假手術(shù)組比較P＜0.05，△為與治療組比較P＜0.01

組別 術(shù)后天數(shù)（天）第1天 第3天 第7天 第14天假手術(shù)組 0.460±0.042 0.366±0.019 0.440±0.033 0.446±0.039梗阻組 3.276±0.39＊△ 4.103±0.701＊△ 5.517±0.561＊△ 4.071±0.336＊△治療組 3.693±0.281 4.980±0.539 6.366±0.598 4.592±0.487

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化 （RIF）幾乎是各種原因所致的腎臟疾病進(jìn)展到終末期演變?yōu)槁阅I功能衰竭的共同病理過程。細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）積聚是RIF主要機(jī)制之一，腎間質(zhì)纖維化與ECM的過度分泌和組織降解ECM的能力異常均有關(guān)系［5］，所以當(dāng)ECM的合成與降解失衡時，會導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)大量廣泛沉積。基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物系統(tǒng) （MMPs/TIMPs）是調(diào)控ECM降解的主要酶系［6］之一。MMPs以無活性的潛酶或酶原形式分泌，在中性p H值下，有內(nèi)在Zn2＋和外在Ca2＋存在時方可發(fā)揮酶的活性，其酶活性可被螯合劑所抑制，也可被金屬蛋白酶組織抑制劑 （TIMPs）抑制［7］。因此，調(diào)控降解酶系的比例及細(xì)胞外基質(zhì)的含量能夠抑制腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化及腎功能不全［8］。MMP－9是Ⅳ型膠原酶，能降解明膠、基底膜膠原 （Ⅳ型膠原），調(diào)節(jié)生理和病理狀態(tài)下ECM的合成和降解平衡。Aresu L等報道MMPs的2種主要亞型MMP－2和MMP－9可以破壞腎小管上皮基底膜的完整，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的遷移及表型轉(zhuǎn)化［9］，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。本實驗中光鏡下可見，腎組織病理改變?yōu)殡S梗阻時間延長間質(zhì)纖維化逐漸加重，與趙春利等［10］報道相一致。免疫組化可見正常腎組織MMP－9在腎小管間質(zhì)微量表達(dá)，UUO術(shù)后1天到7天，腎臟MMP－9的表達(dá)逐漸增加，與程紅新等報道相符［11］，于7天形成高峰，提示UUO大鼠腎組織局部合成MMP－9的活性增加，其降解ECM能力也相應(yīng)增加，是病變腎組織消除過多的ECM，阻止腎組織纖維化形成的一種自身抑制效應(yīng)。而MMP－9的表達(dá)達(dá)到高峰后出現(xiàn)下降，可能是它對基質(zhì)的降解有所減弱，而本實驗中梗阻腎腎間質(zhì)纖維化并未減輕原因可能為：①M(fèi)MP－9前體蛋白的激活減少；②病理因素導(dǎo)致ECM合成增多。

大黃素是從大黃生藥中分離提純的有效成分之一，具有抑菌消炎、抗氧化，以及抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸活動、抗肝腎纖維化等多種藥理作用［12，13］。目前大量的實驗研究均表明，中藥大黃素治療腎纖維化的作用值得肯定。秦建華等認(rèn)為［14］，大黃素抗RIF作用機(jī)制體現(xiàn)在：①大黃素對腎臟細(xì)胞增殖，凋亡及表型轉(zhuǎn)化的影響；②大黃素抑制促纖維化因子的合成與分化；③大黃素調(diào)節(jié)ECM合成與降解。本實驗中大黃素治療組腎組織病理學(xué)損傷顯著減輕，提示大黃素具有抗腎間質(zhì)纖維化作用。大黃素治療組MMP－9表達(dá)高于梗阻組 （P＜0.01），表明大黃素可能通過增加腎組織中MMP－9的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，使堆積減少，從而延緩間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，保護(hù)腎臟功能。

［1］Wada J，Sun L，Kanwar YS.Discovery of genes related to diabetic nephropathy in various animal models by current techniques［J］.Contrib Nephrol，2011，169：161.

［2］Aresu L，Benali S，Garbisa S，etal.Matrix metalloproteinases and their role in the renal epithelial mesenchymal transition［J］.Histol Histopathol，2011，26（3）：307.

［3］Zeisberg M，Neilson EG.Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（11）：1819.

［4］張志新，何立群.腎小管間質(zhì)纖維化動物模型的研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（4）：969－971.

［5］Pozzi A，Voziyan P A，Hudson B G，etal.Regulation of matrix synthesis，remodeling and accumulation in glomerulosclerosis［J］.Curr Pharm Des，2009，15（12）：1318.

［6］Wang BL，Tu YY，F(xiàn)u JF，etal.Unbalanced MMP/TIMP－1 expression during the development of experimental pulmonary fibrosis with acute paraquat－poisoning〔J〕.Mol Med Report，2011，4（2）：243.

［7］王立勉，王少明，周 歡，等.解毒復(fù)腎逐瘀方對腎纖維化大鼠 MMP－2、MMP－9及 TIMP－1表達(dá)的影響［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（8）：39－41.

［8］鄒大威、高彥彬、王金羊，等.通心絡(luò)對自發(fā)性2型糖尿病KK－Ay小鼠腎功能及腎組織 MMP－9、TIMP－1表達(dá)的影響 ［J］.World Chinese Medicine，2013，7（8）：782－786.

［9］Aresu L，Benali S，Garbisa S，etal.Matrix metalloproteinases and their role in the renal epithelial mesenchymal transition［J］.Histol Histopathol，2011，26（3）：307.

［10］趙春利，蔡文清，霍紅旭.急性輸尿管梗阻解除后腎功能可恢復(fù)性的實驗研究［J］.中華外科雜志，2005，43（22）：1480－1481.

［11］程紅新，李麗，蔣雅紅，等.肝細(xì)胞生長因子對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟E－cd、FN和 MMP－9表達(dá)的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（17）：2554－2556.

［12］Liu Y，Wen XM，Lui EL，etal.Therapeutic targeting of the PDGF and TGF－beta－signaling pathways in hepatic stellate cells by PTK787/ZK22258［J］.Lab Invest，2009，89（10）：1152－1160.

［13］魏建波，劉琴，鐘瑜，等.大黃素對大鼠腎間質(zhì)纖維化干預(yù)作用的實驗研究 ［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（5）：337－341.

［14］曹樹琦、傅曉駿.中藥抗腎纖維化的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（13）：2051－2054.

The Effect of Emodin on Expression of Matrix Metalloproteinase－9 in Rat with Renal Tubulointerstitial Fibrosis

Li Dongmei Liu Wei（Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College，Heilongjiang Province，Qiqihar，161006，China）

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of MMP－9 expressions in renal interstitial fibrosis（RIF），and to explore the mechanism of RIF and the effect of emodin.MethodsOne hundred and twenty rats were randomly divided into 3 groups：the sham－operated group，the UUO group and the emodin treated group.Rat in the DTG were administered intragastrically with emodin 40mg/kg daily after modeling.Ten rats of each group were killed respectively at day 1，3，7 and 14 days after UUO.Renal histopathological changes was observed by light microscope.The expression of MMP－9 were examined by HE staining and immunohistochemistry at each time point.ResultsIn UUO rats，the express of MMP－9 firstly increased and then decreased；In DTG group，the express of MMP－9 incrased significantly compared to the same time in the UUO group.ConclusionThe up－regulation of MMP－9 involved in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis.Emodin may suppress fibrosis development and can protect the function of renal.

renal interstitial fibrosis；MMP－9；emodin；herbal purification

10.3969/j.issn.1672－2779.2014.10.097

1672－2779（2014）－10－0160－02

（本文責(zé)編：楊 杰 本文校對：劉興權(quán)

2014－01－16）