唐山大清河鹽場(chǎng)中度嗜鹽菌的分離及功能酶的篩選

胡居猛，賈瑞雪，吳樂(lè)天，杜文博，唐紅梅

（河北聯(lián)合大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000）

唐山大清河鹽場(chǎng)中度嗜鹽菌的分離及功能酶的篩選

胡居猛，賈瑞雪，吳樂(lè)天，杜文博，唐紅梅

（河北聯(lián)合大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000）

為了調(diào)查唐山大清河鹽場(chǎng)的中度嗜鹽菌資源，采集曬鹽場(chǎng)的鹽泥進(jìn)行嗜鹽菌的分離純化，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定和功能酶篩選。結(jié)果分離得到14株中度嗜鹽菌。這些嗜鹽菌的菌落呈黃色或者乳白色，較小，不透明，邊緣整齊；細(xì)菌多呈桿狀，革蘭氏染色均呈陰性。生理生化特征鑒定顯示，14株菌株中的3株甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，3株伏-普試驗(yàn)陽(yáng)性，3株可分解含硫的氨基酸，5株可利用檸檬酸作為碳源。多株菌可釋放功能酶，其中6株產(chǎn)淀粉酶，7株產(chǎn)纖維素酶，7株產(chǎn)脂肪酶和6株產(chǎn)蛋白酶。該研究雖然僅獲取了少量的中度嗜鹽菌，但為開(kāi)發(fā)利用唐山大清河鹽場(chǎng)的嗜鹽菌資源提供了參考。

中度嗜鹽菌；分離；生理生化特征；功能酶

在日光鹽場(chǎng)、鹽堿地、海產(chǎn)品以及鹽漬食品等高鹽環(huán)境中，棲息著數(shù)目眾多的嗜鹽菌。不同類型的嗜鹽菌對(duì)鹽濃度的需求不同，其中中度嗜鹽菌最適生長(zhǎng)鹽濃度為3% -15%（W/V）[1]。中度嗜鹽菌不僅在高鹽環(huán)境中容易生長(zhǎng)繁殖，而且分泌的胞外酶在高鹽環(huán)境下具有較高的活性，所以它被廣泛地應(yīng)用于污水處理、食品、化工等行業(yè)[2]。

我國(guó)擁有廣闊的鹽域環(huán)境和豐富的嗜鹽菌資源，多位學(xué)者已經(jīng)對(duì)新疆、四川、大慶等地的中度嗜鹽菌進(jìn)行研究[3-5]。目前的研究主要集中在分類特征、系統(tǒng)發(fā)育地位、滲透調(diào)節(jié)機(jī)制和生物學(xué)功能等方面，這為確立其分類和分布奠定理論基礎(chǔ)，并且是合理利用這些微生物資源的重要前提。本文采集唐山大清河鹽場(chǎng)的鹽泥進(jìn)行嗜鹽菌的分離純化，得到14株中度嗜鹽菌，并對(duì)它們進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定和功能酶篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年4月采集唐山大清河鹽場(chǎng)的鹽土，裝于無(wú)菌牛皮紙袋中，密封帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在4 ℃冰箱。

改良營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（每升中含有蛋白胨7.5 g；酵母浸膏10 g；NaCl 50 g；瓊脂20 g，pH 8.3）、生理生化鑒定培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基均由河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和純化

稱取10.0 g鹽土裝入帶有玻璃珠的無(wú)菌燒杯中，加90 mL無(wú)菌蒸餾水，震蕩30 min充分混勻。取上清液倍比稀釋涂布于含有5% NaCl（W/V）的改良營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取不同類型的單菌落反復(fù)劃線，直至獲得純種，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學(xué)特征

劃線接種于5% NaCl（W/V）的改良營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，25 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。挑取少量菌體，稀釋后固定，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形狀、大小和染色反應(yīng)。

1.2.3 生理生化試驗(yàn)

參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]。

甲基紅試驗(yàn)（M. R.試驗(yàn)）。將篩選出的菌株分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)24 h，加甲基紅指示劑5滴，觀察結(jié)果。呈現(xiàn)紅色者說(shuō)明pH下降到4.2以下，為陽(yáng)性，能夠利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等；呈現(xiàn)黃色者pH值大于6，為陰性。

伏—普試驗(yàn)（V. P.試驗(yàn)）。將篩選出的菌株分別接種到葡萄糖蛋白胨水中，32 ℃培養(yǎng)24 h，加入40%KOH 7滴，然后再加入等量的5%a-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37 ℃溫箱中保溫30 min。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，則細(xì)菌能夠利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，為伏—普反應(yīng)陽(yáng)性；若培養(yǎng)基仍為黃色，為陰性。

硫化氫試驗(yàn)。將篩選出的菌株用接種針穿刺接種到醋酸鉛培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。若有黑色出現(xiàn)，則細(xì)菌具有分解含硫的氨基酸能力，為陽(yáng)性；反之，為陰性。

檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。將篩選出的菌株接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。若培養(yǎng)基變深藍(lán)色，細(xì)菌可利用檸檬酸鹽作為碳源，為陽(yáng)性；反之，不能利用，為陰性。

1.2.4 酶的篩選

淀粉酶。培養(yǎng)基中加入1%可溶性淀粉制成平板，接種菌液，25 ℃培養(yǎng)48 h后，碘液均勻鋪于平板上，菌落周?chē)粲型该魅φf(shuō)明該菌株可產(chǎn)生淀粉酶，為陽(yáng)性；反之為陰性。

纖維素酶。將菌株接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)48 h后，用0.1%的剛果紅水溶液浸染30 min，菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈為陽(yáng)性；反之為陰性。

脂肪酶。培養(yǎng)基中添加1% Tween 20制成平板，接種菌液25 ℃培養(yǎng)48 h，菌落周?chē)粲邪咨珪炄Γf(shuō)明該菌株可代謝產(chǎn)生脂肪酶，為陽(yáng)性；反之為陰性。

蛋白酶。菌株接種到含1%脫脂牛奶的培養(yǎng)平板25 ℃培養(yǎng)48 h，菌落周?chē)粲邪咨珪炄ΓC明該菌株可代謝產(chǎn)生蛋白酶，為陽(yáng)性；反之為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

從大清河鹽土的樣品中分離得到具有代表性的14株中度嗜鹽菌，依次編號(hào)為1-14。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

這些菌株形成的菌落呈黃、白色兩種顏色，較小，圓形，向上隆起，不透明，邊緣整齊。細(xì)菌的革蘭氏染色呈陰性。細(xì)胞的形狀大部分是桿狀，少數(shù)為球狀；大小不一，最大長(zhǎng)度達(dá)1 μm，最小的只要0.2 μm。結(jié)果如表1所示。

表1 菌株的染色反應(yīng)

2.3 生理生化特征

結(jié)果如表1所示，菌株2、3和9能夠利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等；菌株6、7和9具有利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力；菌株4、6、7具有分解含硫的氨基酸能力；菌株4、6、7、11和13能利用檸檬酸鹽為碳源。

2.4 功能酶

結(jié)果如表1所示，1、3、4、6、8和9這6株菌株具有產(chǎn)淀粉酶的能力；菌株2、3、6、7、9、10和12均可產(chǎn)纖維素酶降解纖維素，其中3，9和10這3株產(chǎn)酶較多，透明圈與菌落的直徑比達(dá)4.0倍。1、3、5、6、7、9和13菌株可以產(chǎn)脂肪酶，其中菌株9產(chǎn)酶量最多，透明圈與菌落的直徑比是1.8倍。2、3、7、9、12和13號(hào)菌株能產(chǎn)生蛋白酶，比較而言菌株7產(chǎn)酶量最多，透明圈與菌落的直徑比是1.7倍。

3 討論

嗜鹽菌通常是指需要NaCl才能生長(zhǎng)的微生物，而不是分類學(xué)上的名詞。研究表明，超過(guò)2 mol/L NaCl的條件下，嗜鹽菌主要是古生菌，幾乎不存在真細(xì)菌[7]。在研究中使用了5%（W/V）NaCl的培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，所以分離到的細(xì)菌全部是真細(xì)菌。細(xì)菌的確切種屬，最可靠的證據(jù)是分析16S rDNA序列，這部分研究工作有待于進(jìn)行。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，中度嗜鹽菌的新種不斷地被報(bào)道，這增加了嗜鹽菌的多樣性。值得注意的是，微生物對(duì)鹽的耐受能力存在的差異，這取決于環(huán)境條件，所以不同的培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)均會(huì)影響到嗜鹽菌的分離。富集到更多的嗜鹽菌是進(jìn)行嗜鹽菌分類學(xué)研究的必要條件。該研究采用25 ℃、5% NaCl改良普通瓊脂分離中度嗜鹽菌，為這方面的研究工作提供了線索。

極端環(huán)境下的微生物體內(nèi)的酶往往具有獨(dú)特性質(zhì)，如耐受高溫、低溫、高鹽、高堿等外界條件。高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)的嗜鹽菌也不例外。從唐山大清河鹽場(chǎng)分離的菌株中，多株嗜鹽菌可釋放胞外功能酶，個(gè)別菌株產(chǎn)酶活性較高。如果對(duì)這些菌株的產(chǎn)酶條件以及酶的性質(zhì)深入研究，將具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

[1] Ventosa A, Nieto J J, Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62(2): 504-544.

[2] 趙百鎖,楊禮富,宋蕾,等.中度嗜鹽菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2007,34(2):359-362.

[3] 孟凡旭,吳敏,張會(huì)斌,等.阿牙克庫(kù)木湖嗜鹽茵的分離及功能酶的篩選[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2006,33(6): 671-674.

[4] 馮瑋,向文良,郭建華,等.四川大公古鹽井中可培養(yǎng)中度嗜鹽菌的初步分析[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(11): 1691-1697.

[5] 王爽,楊謙,孫磊,等.鹽堿土中可培養(yǎng)中度嗜鹽菌的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(8):37-42.

[6] 李秀珠,蔡妙英.常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[7] Kamekura M. Diversity of extremely halophilic bacteria [J]. Extremophiles, 1998, 2(3): 289-295.

（責(zé)任編輯、校對(duì)：李春香）

The Isolation and Enzyme Screening of Moderate Halophilic Bacteria from Tangshan Daqinghe Saltwork

HU Ju-meng, JIA Rui-xue, WU Le-tian, DU Wen-bo, TANG Hong-mei
(College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000, China)

The research aims to investigate the resources of moderate halophilic bacteria from Daqinghe saltwork of Tangshan. Mud samples are obtained from it, and 14 halophilic strains are isolated. They are small opaque colonies which are yellow or milky white. The cells of the isolates are mostly rod or cocci shaped and all the strains are gram negative. Physiological biochemical characteristics are analyzed. The important enzymes from these strains are screened subsequently. The results show that 6 strains produced amylase, 7 strains produced cellulose, 7 strains produced lipase and 6 strains produced protease. This research is to obtain a small amount of moderate halophilic bacteria, it provides references for reasonable development and utilization of halophilic microbial resources.

moderately halophilic bacteria; isolation; physiological biochemical characteristics; enzyme

Q93-3

A

1009-9115(2014)02-0052-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2014.02.015

河北聯(lián)合大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)（X2012057）

2013-11-08

胡居猛（1990-），男，江蘇徐州人，本科生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與分子生物學(xué)研究。

唐紅梅（1973-），女，遼寧莊河人，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。