三七總皂苷誘導U937細胞凋亡及對Caspase-3表達的影響

目的觀察三七總皂苷（PNS）對人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞的增殖、凋亡及Caspase-3表達的影響。方法用不同濃度PNS作用于U937細胞，采用MTT法檢測細胞增殖活性，用流式細胞術檢測細胞周期和凋亡，Western-blot法檢測Caspase-3蛋白表達。結果PNS抑制U943細胞生長并呈時間和劑量依賴性；分別予100、200、400、800mg/L處理U937細胞48h，細胞凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細胞凋亡率為（1.73±1.50）%（P＜0.01），并誘導細胞G1期阻滯；Western-blot結果顯示，PNS使Caspase-3蛋白表達上調。結論PNS能抑制U937細胞增殖，并可能通過上調Caspase-3蛋白表達誘導細胞凋亡。

三七總皂苷；U937細胞；凋亡；Caspase-3

三七總皂苷（panax notoginseng saponis，PNS）是從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀，活絡通脈等功效。近年來，許多實驗及臨床研究發現，PNS對肝癌、胃癌、前列腺癌、婦科腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤具有抗腫瘤作用[1-5]。但PNS對人急性單核細胞白血病的研究資料甚少。本文采用不同濃度PNS作用于人急性單核細胞白血病細胞系U937，觀察其對U937細胞增殖及凋亡的影響，為進一步研究PNS抗白血病作用提供實驗依據，旨在擴展急性髓性白血病的輔助治療方法。

1 實驗材料

1.1藥物及材料 人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞由本實驗室保存；PNS凍干粉針劑購自廣西梧州制藥有限公司；IMDM培養基購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（DSMO）、四甲基偶氨唑藍（MTT）購自Sigma公司；細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自Invitrogen公司；一抗購自Santa Crusz公司。

1.2主要儀器及設備 二氧化碳培養箱（Thermo），酶標儀（BioTek，ELx808IU），流式細胞儀（BD），電泳槽、電泳儀、蛋白轉印系統（Bio-Rad）

2 實驗方法

2.1細胞培養 將U937細胞接種于含10%新生牛血清的IMDM培養液中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。每2～3天換液1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2分 組 設實驗組和空白對照組。PNS按劑量不同分為50、100、200、400、800、1600、3200mg/L七組，未加藥組為對照組。

2.3細胞生長抑制率測定 采用噻唑藍（MTT）還原法進行檢測。將1×105/mL濃度的U937細胞接種于96孔培養板內，每孔200μL，每組設6個平行孔。分別作用于24、48、72h后，加入MTT（濃度5mg/mL），繼續培養4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μL，在自動酶標儀上進行比色（測試波長490nm），自動記錄每孔吸光度（D）值，計算不同濃度PNS對U937細胞的生長抑制率：抑制率（%）=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。

2.4流式細胞術（FCM）檢測細胞周期和凋亡率

收集U937細胞，離心1000rpm，5min，去培養基，冷PBS洗滌1次。用1×Annexin-binding buffer重懸細胞約1×106/mL，取100uL，加5μL Annexin V和1μL 100μg/mL PI，室溫5min，加400μL1×Annexin-binding buffer，輕輕混勻，放于冰上，進行FCM分析。

2.5Western-blot法檢測Caspase-3蛋白 收集細胞，PBS洗滌，抽提細胞裂解液。蛋白上樣量40μg，SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉移，1%BSA封閉，1h。一抗1：1000稀釋，1.5h；二抗1：8000稀釋，1h，ECL顯影。

2.6統計學方法 數據用（） 表示，應用SPSS10.0軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1PNS對U937細胞增殖的影響 PNS對U937細胞的生長有明顯的抑制作用，并且隨濃度增加，作用時間延長，細胞抑制率明顯升高（P＜0.05）。不同濃度PNS作用于U937細胞48h，隨著PNS濃度增加抑制率增加，100mg/L以上濃度可明顯抑制U937細胞增殖（P＜0.01），見表1。

表1 PNS對U937細胞增殖的影響（n=3，）

表1 PNS對U937細胞增殖的影響（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.01

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3.2PNS對U937細胞周期和凋亡的影響 分別用100、200、400、800mg/L的PNS處理U937細胞48h后，誘導細胞G1期阻滯，停留于G1期的細胞增加，并誘導細胞凋亡，凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細胞凋亡率為(1.73±1.50%)（P＜0.01），呈劑量依賴性方式，見表2，圖1（封二）。

表2 不同濃度PNS作用于U937細胞后細胞周期分布（n=3，） %

表2 不同濃度PNS作用于U937細胞后細胞周期分布（n=3，） %

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3.3PNS對U937細胞Caspase-3蛋白表達的影響

用不同濃度PNS作用于U937細胞72h，Caspase-3蛋白的表達隨濃度增加逐漸上調，見圖2（封二）。

4 討論

腫瘤的發生、發展與細胞凋亡調控和細胞增殖調控紊亂密切相關。細胞凋亡即程序性細胞死亡，主要有線粒體途徑、死亡受體介導途徑和內質網應激介導途徑。這三條途徑最終都會激活Caspase-3，Caspase-3是細胞凋亡反應中的執行者和關鍵酶，直接參與介導細胞凋亡過程[6]。通過活化脫氧核糖核酸酶，引起細胞染色體斷裂，發生細胞凋亡[7]。Caspase-3是真核細胞中的凋亡蛋白，屬半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，大多數的細胞凋亡與之相關[8]。

PNS是中藥三七的主要成分，廣泛應用于心血管系統、中樞神經系統、血液系統、免疫系統及抗衰老等方面[8-10]。近年來，隨著國內外學者不斷的深入研究，發現PNS具有多靶點抗腫瘤作用，可通過抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡和分化、逆轉腫瘤多藥耐藥、增強機體免疫功能等多種方式發揮抗腫瘤作用[11-13]。

本實驗用PNS作用于人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞，實驗結果顯示，PNS可以有效抑制U937細胞增殖，細胞生長抑制作用隨濃度增加及作用時間增加而增強。細胞周期分析顯示，PNS可以使G1期細胞含量較對照組增高，顯示G1期阻滯，并呈濃度依賴性。同時，PNS作用于U937細胞48h后，與對照組比較，100、200、400、800mg/L組均可顯著誘導U937細胞的凋亡。PNS可以使U937細胞Caspase-3蛋白表達增強，并且隨濃度增加蛋白表達增強。

本研究結果表明，PNS具抑制U937細胞增殖的作用，呈時間和濃度依賴性，并能夠影響細胞周期，阻滯U937細胞于G1期，使Caspase-3蛋白表達增強，誘導細胞凋亡。

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三七總皂苷誘導U937細胞凋亡及對Caspase-3表達的影響

王 瀟 陳小紅 尹利明 高瑞蘭 浙江省中醫院 杭州310006

Effect of Panax Notoginseng Saponis on Apoptosis of and Caspase-3 in U937 cells

WANG Xiao，CHEN Xiaohong，YIN Liming，GAO Ruilan.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponis（PNS）on proliferation and apoptosis of human acute monocytic leukemia cell line U937 and the expression of caspase-3 in it.MethodsU937 cells were treated with PNS at different concentrations.Cell proliferation was analyzed by MTT assay.Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry,and the expression of Caspase-3 protein was detected by Western blot.ResultsThe inhibition of cell proliferation in U937 cells exposed to PNS was in a dose and time dependent manner.At 48 hours after exposure to 100，200，400，800 mg/L PNS，the apoptotic rates of U937 cells were（5.93± 0.15）%，（7.43±0.70）%，（12.3±0.38）%and（20.4±0.91）%，respectively，which were markedly higher than that of control group（1.73±1.50%，P＜0.01）.The exposure to PNS induced the G1 phase arrest of U937 cells and up-regulated the expression of Caspase-3 protein in U937 cells.ConclusionPNS can inhibit the proliferation of U937 cells and induce apoptosis by up-regulating the expression of Caspase-3.

panax notoginseng saponis；U937 cells；apoptosis；Caspase-3

2013-12-23

2014-02-13

·臨床報道·