Survivin和PLK1在急性白血病中的表達及臨床意義

于廣晴，趙田華，倪 蕾，張小霞，趙悅榮

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

急性白血病是造血系統的惡性克隆性疾病，發病時骨髓中異常的原始細胞及幼稚細胞大量增殖并抑制正常造血。該病發展快、預后差，病死率高。目前對其發病機制尚未完全清楚。其治療方法仍主要以化療、骨髓移植為主，其副作用大，同時患者生存質量差，故我們積極探討其發病原因的同時，迫切需要尋找一種能夠靶向治療急性白血病的方法，盡可能減少傳統化療方法的嚴重不良反應。目前有關實體腫瘤靶向治療的新靶點的報道層出不窮，但是白血病治療靶點相關報道甚少。據有關文獻報道其機制為在AL中Survivin蛋白可能是PLK1的靶基因之一，兩者可能發揮協同作用，相互促進腫瘤的發生發展[1]。

腫瘤是機體細胞在多種致瘤因素作用下產生的增生、分化異常的新生物。其主要表現為生長失控、凋亡受阻。近年有關報道指出，在這一系列復雜的過程當中需要多種細胞組份參與，PLK1和Survivn就是這眾多組份中起關鍵作用的蛋白，它們的生物學功能與實體腫瘤的發生及惡性進展關系密切[2，3]。本實驗在于研究急性白血病患者骨髓細胞中PLK1和Survivn蛋白的表達水平及二者相關性，探討它們在臨床治療急性白血病中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 病例來源

隨機動態選取佳木斯大學附屬第一醫院2011-10～2013-12期間54例初治AL患者骨髓細胞樣本，其中男32例，女22例；年齡10～75歲，中位年齡35歲。留取初治組完全緩解后標本,其中ALL-CR組19例,AML-CR組11例。選取佳木斯大學附屬第一醫院2011-10～2013-12體檢其他方面均正常，既往身體健康，無其他系統疾病人群19例作為對照組，其中男9例，女10例，年齡22～69歲，中位年齡45.5歲。

1.2 標本處理

取骨髓1mL，抗凝處理，加淋巴細胞分離液適量，離心，吸取單個核細胞調整細胞數量涂片制備好標本玻片，用保鮮膜包裹密封后裝盒,-20℃冰箱保存備用。

1.3 方法及主要試劑

采用免疫細胞化學方法檢測PLK1和Survivin表達情況實驗所用試劑為SP-9002免疫組化染色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。濃縮型鼠抗人PLK1單克隆抗體(0.2mL)購于上海長島生物技術有限公司。濃縮型鼠抗人Survivin單克隆抗體(0.lmL)購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 判定結果

PLK1和Survivin陽性細胞以細胞膜和(或) 細胞質呈現淺黃或棕褐色顆粒計為染色陽性。顯微鏡下計數500個細胞(參考中性粒細胞堿性磷酸酶結果判斷方法),按照染色強度和染色細胞百分數進行評分，其中A(染色強度)評分標準即：0分為無色、1分為淺黃色、2分為綜黃色、3分為棕褐色；B(染色細胞百分數)評分標準即：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；A×B結果：0～1分、≥2分、2～3分、≥4分別為陰性(-)、弱陽性、中陽性(+)、強陽性(++)。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件處理,采用卡方檢驗對表達積分陽性率進行顯著性分析,相關性分析應用Spearman進行,以α=0.05為檢驗水平。

2 結果

2.1 各組PLK1和Survivin表達水平

PLK1和Survivin在AML和ALL初治組患者骨髓細胞中的表達水平均顯著高于正常完全緩解組和正常對照組，差異具有顯著意義(P<0.05)；PLK1高表達組CR率低于低表達組,Survivin高表達組CR率低于低表達組,差異有顯著性(P<0.05)。說明PLK1和Survivin得過表達對急性白血病的發生和惡性進程可能產生了不同程度地影響，可作為急性白血病臨床預后判斷的檢測指標。見表1～2。

2.2 PLK1和Survivin表達水平相關性

初治急性白血病(AL)患者骨髓單個核細胞中PLK1的表達陽性率為66.7%，Survivin的表達陽性率為55.6%，PLK1的表達與Survivin的表達在AL中呈正相關(r=0.515,P<0.05)。見表3。

表1 PLK1在初治AL各組骨髓單個核細胞中的表達

*與正常對照比較，P<0.05;*與完全緩解組比較，P<0.05。

表2 Survivin在初治AL各組骨髓單個核細胞中的表達

*與正常對照比較，P<0.05;*與完全緩解組比較，P<0.05。

表3 初治AL中Survivin與PLK1蛋白表達的相關性

3 討論

3.1 PLK1在急性白血病骨髓細胞中的表達及意義

PLK1(polo-like kinase-1)它屬于Polo樣激酶家族PLKs(polo-like kinase)的一員，由瑞士實驗室腫瘤研究所的Golsteyn等在1994年最先報道[4]。生物化學和細胞生物學研究提示，Plk1 是細胞周期相關事件的重要調節因子，參與到細胞有絲分裂、細胞凋亡、細胞周期檢驗等過程，所有這些生物學功能均與腫瘤的發生、發展關系密切。

我們的實驗結果提示PLK1在初治組AL患者骨髓單個細胞中表達增高，其細胞膜和(或)細胞漿的陽性表達率為66.7%，PLK1在髓系和淋巴系的表達均較正常對照組明顯增高(陽性率分別為：63.6%、71.4%、5.3%),差異存在顯著統計學意義(P<0.05)。我們的實驗結果還顯示,PLK1在初治AL中的表達與完全緩解后(CR)后的表達(陽性率分別為66.7%、13.3%)相比,其差異有統計學意義(P<0.05),而且初治AML與AML-CR(陽性率分別為63.6%、5.3%)相比，初治ALL與ALL-CR(陽性率分別為71.4%、27.3%)相比,差異均有統計學意義(P<0.05)。PLK1高表達組的完全緩解(CR)率低于PLK1低表達組的完全緩解(CR)率，分別為35.6%、67.6%,其差異有統計學意義(P<0.05)。我們的實驗結果與國外有關報道顯示出了相同結果[3]。故PLK1有可能作為急性白血病診斷、治療和預后的指標應用于臨床，并成為急性白血病的治療新的靶點。

3.2 Survivin在急性白血病骨髓細胞中的表達及意義

Survivin(生存素)是于1997年由耶魯大學的Ambrosini G等應用效應細胞蛋白酶受體-1cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中首先分離出來。其分子量為16.5KD。Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白( IAP)家族中結構獨特的一個新成員，并且是分子量最小的IAP成員[5]。Survivin參與細胞周期調控的主要機制是與AuroraB和INCENP結合形成一個染色體通道蛋白復合體定位于著絲粒和中間體上進而調控細胞周期,它主要參與了紡錘體的組裝以及細胞周期檢測點的調控，同時肩負著對細胞凋亡過程的調控，最近更有報道指出 Survivin與新生血管形成關系密切。

我們的實驗結果顯示Survivin在初治急性白血病患者骨髓細胞中過度表達,其細胞膜和(或)細胞漿陽性率達到55.6%，Survivin在髓細胞白血病和淋巴細胞白血病(陽性率分別為54.5%、57.1%)的表達較對照組(陽性率為10.5%)均有明顯增高,差異有顯著統計學意義(P<0.05),但Survivin在髓細胞白血病和淋巴細胞白血病的表達相比,其差異不存在統計學意義(P>0.05)。實驗結果進一步顯示Survivin在初治急性白血病中的表達與完全緩解(CR)后的表達(陽性率分別為55.6%、10%),其差異存在顯著統計學差異(P<0.05)；并且初治AML與AML-CR(陽性率分別為54.5%、5.3%)、初治ALL與ALL-CR(陽性率分別為57.1%、18.2%)之間均有統計學意義(P<0.05)。故我們有理由相信未來Survivin可作為臨床診斷和治療的指標。

本實驗結果還顯示,Survivin高表達組與低表達組相比其完全緩解(CR)率明顯降低，分別為31.6%、68.6%,其差異存在統計學意義(P<0.05)。Kitada等發現,抗凋亡蛋白Survivin的高表達與低完全緩解(CR)率相關(P=0.05)[5]。本實驗結果與該實驗結果相似。這不禁使我們相信Survivin有希望作為臨床預后判斷指標被廣泛推廣。近幾年Survivin在實體瘤中研究報道指出,Survivin的過度表達與腫瘤細胞的浸潤及遠處轉移特性關系密切。

3.3 急性白血病骨髓細胞中PLK1和Survivin的關系及意義

腫瘤的發生和發展是復雜的細胞調控的過程，細胞周期的各個要素均參與這一過程中，綜上所述，PLK1和Survivin蛋白參與細胞有絲分裂調節、凋亡調控、細胞周期檢驗等各各方面。我們的實驗結果表明PLK1和Survivin的表達呈正相關，提示它們在AL的發生和發展過程中起協同作用，共同促進急性白血病的發生發展。

近年的研究表明，PLK1和Survivin亦可參與腫瘤新生血管的形成，并且在其發生、發展、侵襲、轉移等過程中起到主要作用。故針對二者的生物學作用為靶點的新的治療白血病的方法，有望為急性白血病治療開辟新的思路，提供廣闊的應用前景，值得進一步研究和探索。

[1]Toyoshima Morimoto F, Taniguchi E, Nishida E，et al.PLK1promotes nuclear translocation of human Cdc25C during prophase[J].Clin Cancer Res,2002,3(4):8-7

[2]Sunkel,CE，DM Glover，Polo, et al.A mitotic mutant of Drosophila displaying abnormal spindle poles[J].Cell Sci,1988,89 (10):25-38

[3]Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, et al.Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an “off-target” effect [J].Mini Rev Med Chem, 2007,96(12): 1035-1039

[4]Mori A,Wana H,Nishimura Y, et al.Expression of the apoptosis gene survivin in human leukemia[J].Int J Hematol, 2002, 75(2):161-165

[5]張純，張淑萍，樊英麗，等.抗凋亡蛋白survivin在急性白血病細胞中的表達及臨床意義[J].黑龍江醫藥科學，2003，26(6)：3-4