自擬止瀉方通過調節Th17細胞功能治療小兒遷延性腹瀉的臨床觀察

張憲偉 孫 杭

（南京醫科大學附屬南京兒童醫院檢驗科，南京，210008）

自擬止瀉方通過調節Th17細胞功能治療小兒遷延性腹瀉的臨床觀察

張憲偉 孫 杭

（南京醫科大學附屬南京兒童醫院檢驗科，南京，210008）

目的：觀察自擬止瀉方對小兒遷延性腹瀉的臨床療效以及其部分調節機制的研究。方法：將本院2010年3月至2013年3月100例延性腹瀉的患兒納入研究，對照組50例患兒接受內科常規治療，觀察組50例在對照組治療基礎上加用自擬止瀉方，觀察2組患兒均以10 d為1個療程，療程結束后觀察2組患兒臨床癥狀的變化，同時采用流式細胞術檢測外周血中Th17細胞表達水平，ELISA檢測患者血清中IL-6、IL-17、IL-23的蛋白表達水平。結果：1）2組患兒體溫恢復時間、嘔吐停止時間比較差異無統計學意義（P＞0.05），但是觀察組患兒腹瀉停止時間短于對照組（P＜0.05）；2）治療后2組患兒血清中IL-6、IL-17、IL-23水平低于治療前（P＜0.05），治療1個療程后觀察組患者IL-17、IL-6、IL-23水平下降趨勢較對照組患兒明顯（P＜0.01）；3）隨訪3個月后發現，觀察組患兒的體重增長明顯高于對照組患兒（P＜0.05）。結論：遷延性腹瀉患兒存在Th17細胞表達增加，功能亢進，自擬止瀉方可以明顯下調Th17細胞表達頻數及功能，該效應可能是自擬止瀉方從機體免疫方面改善遷延性腹瀉的作用機制之一。

遷延性腹瀉；自擬止瀉方；Th17細胞；IL-6；IL-17；IL-23

感染性腹瀉是屬于世界性的公共衛生問題，其以大便次數以及大便性狀的改變為主要臨床癥狀，其中小兒是腹瀉的主要發病人群，如果急性腹瀉無法得到及時、合理的治療將即為可能轉變為遷延性腹瀉，造成兒童的營養不良、生長發育遲緩、免疫功能低下等，影響生活質量［1-3］。隨著目前臨床抗生素的濫用，細菌耐藥性現象越來越嚴重，且由于各類西藥都可能產生不同程度的不良反應導致患兒無法耐受，所以，探尋更安全有效的遷延性腹瀉治療方案尤其重要，中藥湯藥的治療價值逐漸受到重視。從中醫學角度認為遷延性腹瀉乃先天不足，后天調護失宜，病后體弱，以致脾胃虛弱，不能升清降濁谷反成滯，水反為濕，合污下降而成，本院根據上述病機自擬止瀉方予患兒口服，療效顯著，但其治療機制尚未清楚。

CD4+T細胞是免疫反應以及炎性反應性疾病的重要調節者，遇到特異性抗原后，他們被激活并增殖分化為不同的效應T細胞亞群，如Th1型輔助細胞（Th1）、調節性T細胞（Treg細胞）抑制炎性反應的發生、發展，Th2細胞及產生白細胞介素17（IL-17）的T輔助17型細胞（Th17細胞）則促進炎性反應進程。已有文獻表明在腹瀉患者中存在Treg細胞比率降低，Th17細胞比率升高的TregTh17失衡［4-6］，但Th17細胞及其相關作用因子IL-6、IL-17、IL-23在疾病過程中發揮的作用尚未明確。于是我們假設，小兒遷延性腹瀉與機體免疫功能存在密切聯系，那此病的發生發展是否與Th17細胞功能相關，而自擬止瀉方是否通過該途徑發揮作用，本研究擬通過檢測自擬止瀉方對于遷延性腹瀉患兒治療前后Th17細胞及其相關作用因子IL-17、IL-6、IL-23的表達變化進一步闡明Th17細胞及其作用因子IL-17、IL-6、IL-23在遷延性腹瀉中發揮的作用并探討自擬止瀉方對Th17細胞功能的調節作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 將本院2010年3月至2013年3月100例延性腹瀉的患兒納入研究，所有入組患兒診斷均符合2008年出版的全國高等醫學教材中關于中國腹瀉病的診斷標準。100例患兒根據入院順序隨機分為對照組和觀察組，對照組50例，男27例，女23例，年齡7個月至5歲，平均（2±0.8）歲，大便次數3～12次d，平均（6±1.7）次；觀察組50例，男29例，女21例，年齡6個月至4.5歲，平均（2±0.8）歲，大便次數4～11次d，平均（5±2.1）次。2組患兒在年齡、性別、每日大便次數等方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案經過醫院倫理學委員會審查批準，所有受試對象家屬均知情同意。

1.2 治療方法 所有患兒均接受內科常規治療，均以去乳糖配方奶飲食，有脫水癥狀的患兒予補液糾正，思密達口服［蒙脫石散，國藥準字H20000690博福-益普生（天津）制藥有限公司，3 g袋］，1歲以下，1袋日；1～2歲，1～2袋d；2歲以上，2～3袋d，均分三次服用。觀察組患兒在上述治療方案基礎上加服本院自擬止瀉方，具體方藥如下：黃芪20 g，炒白術9 g，防風6 g，山藥6 g，干姜6 g，肉豆蔻6 g，甘草3 g，水煎藥方100 m L，1劑d（早晚分服）。

1.3 觀察指標 臨床癥狀改善情況：2組患兒體溫恢復時間、嘔吐停止時間、Th17細胞水平的變化、IL-6、IL-17、IL-23濃度變化。

1.4 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清（美國Thermo公司）；人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；佛波酯（PMA）、離子霉素（Ion）、莫能菌素（Mon）、破膜劑、CD4-FITC、IL-17AAPC流式抗體、人細胞因子IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）；酶標儀（美國Thermo labsystem公司）；BD FACSVerseTMSystem（美國BD Biosciences公司）。

1.5 檢測方法

1.5.1 Th17細胞檢測 取患兒治療前后前臂外周抗凝血5 mL，用人淋巴細胞分離液提取外周血單核細胞（PBMC，1×106mL）200μL，置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，加入刺激劑佛波醇乙酯（PMA）及離子霉素、莫能霉素等工作液并混勻，置于37℃，5%CO2。培養箱中培養4～6 h。用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，離心收集細胞，加人5μL異硫氰酸熒光素標記的CD4（CD4-FITC）、5μL藻紅蛋白標記的IL-17（IL-17A-APC），操作按試劑盒說明書進行，采用流式細胞儀檢測Th17細胞。

1.5.2 細胞因子檢測 取從患兒治療前后前臂外周血2 mL置入肝素鈉抗凝管內，以3 000 rmin高速離心后，取上清液置于-80℃冰箱保存，按照IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統計學分析 全部數據采用SPSS 17.0和Graph-Pad Prism 5軟件進行統計分析，所有數據用均數±標準差（±s）表示。多組數據的比較先進行Shapiro-Wilk tes t檢驗正態性和Levene tes t檢驗方差齊性。若兩者都符合，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用LSD-t檢驗進行多樣本均數間的兩兩比較。若有至少一項不符合，則采用Kruskal-Wallis H檢驗和Dunn's多重檢驗對各組數據進行統計分析。以α＝0.05作為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患兒臨床癥狀比較 2組患兒體溫恢復時間、嘔吐停止時間比較差異無統計學意義（P＞0.05），但是觀察組患兒腹瀉停止時間與對照組比較有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

2.2 自擬止瀉方顯著抑制遷延性腹瀉患兒外周血中Th17細胞的表達 對不同組患兒外周血進行流式細胞術檢測CD4+IL-17+結果顯示：觀察組治療后CD4+IL-17+T細胞百分率（0.895±0.309）%，顯著低于治療前［（0.895±0.309）%vs（2.556±0.491）%，｜t｜＝22.07，P＝0.000 8＜0.001］及對照組治療后［（0.895 ±0.309）%vs（1.262±0.247）%，｜t｜＝3.676，P＝0.009＜0.01］，見圖1，自擬止瀉方可以顯著降低抑制遷延性腹瀉患兒外周血中Th17細胞表達。

表1 2組患兒臨床癥狀比較（±s）

表1 2組患兒臨床癥狀比較（±s）

注：與觀察組比較，*P＜0.05。

組別例數體溫恢復時間（d）嘔吐停止時間（d）腹瀉停止時間（d）觀察組50 1.88±0.92 2.23±0.44 5.61±1.26對照組50 1.83±0.84 2.30±0.18 7.56±1.73*P 0.08 0.09 0.02 t 3.54 4.79 3.91

圖1 2組患兒外周血中CD4、IL-7+T細胞百分率變化

2.3 自擬止瀉方能顯著抑制遷延性腹瀉患兒血清中Th17細胞功能細胞因子的表達 治療后2組患兒血清中IL-6、IL-17、IL-23水平低于治療前（P＜0.05），治療1個療程后觀察組患者IL-17、IL-6、IL-23水平下降趨勢較對照組患兒有統計學意義（P＜0.01）；見表2。

表2 2組指標變化比較（±s）

表2 2組指標變化比較（±s）

注：與治療前相比，*P＜0.05；與對照組相比，△P＜0.05。

組別IL-6（μgL）IL-17（μgL）IL-23（μgL）觀察組治療前22.89±0.93 34.65±0.71*39.65±2.40治療后9.31±0.31*△10.69±0.08*△14.92±1.76*△對照組治療前23.03±0.81 34.94±0.92*38.44±2.17治療后16.92±0.41*5.91±0.20*25.28±1.31*

3 討論

遷延性腹瀉是造成兒童嚴重營養不良、發育不全、免疫力低下的主要原因，本研究2組患兒的體溫恢復時間、嘔吐停止時間雖然相近，但是加用自擬止瀉湯的患兒腹瀉停止時間短于常規治療組患兒，說明可將自擬止瀉湯做為治療遷延性腹瀉的主要輔助手段。由于遷延性腹瀉發病機制較為復雜，患兒機體免疫病理損傷在發病過程中發揮主要作用，免疫系統紊亂及細胞因子網絡失衡是遷延性腹瀉重要的致命因素之一，因此，糾正遷延性腹瀉患者的免疫調節紊亂及細胞因子網絡的失衡具有重大的防治意義，而外周血T細胞亞群是反映遷延性腹瀉免疫狀態的重要指標［7-8］。筆者根據這一思路，希望從外周血T細胞亞群的功能變化探討自擬止瀉湯的作用機制。

Th17細胞是與Thl、Th2的CD4+T細胞亞群不同的新發現細胞，有文獻證實：Th17細胞可能擔負著調節機體自身免疫和炎性反應的角色，多數遷延性腹瀉患兒存在機體免疫功能異常以及消化道炎性反應，由于炎性反應因子（IL-6）的存在，幼稚的CD4+T細胞分化為Th17細胞，并產生其主要效應因子是IL-17，而IL-17已被證實是一種促炎因子，其與受體結合后可誘導機體產生多種炎性反應因子，如IL-23等，影響機體免疫應答，所以Th17細胞分化和免疫功能的調控研究具有重要的基礎和臨床應用價值［9-15］。本研究通過觀察2組患兒血清中Th17細胞的數量及功能，發現經過治療后2組患兒外周血中Th17細胞表達頻率均較治療前降低，考慮遷延性腹瀉發生時，大量Th17細胞被活化，通過分泌IL-6、IL-17、IL-23來招募中性粒細胞細胞等參與腸道炎性反應過程，而自擬止瀉方逆轉此過程，明顯降低Th17細胞表達頻率及IL-6、IL-17、IL-23濃度，因此糾正了患兒的臨床癥狀。

中醫學認為遷延性腹瀉是先天不足，后天調護失宜，病后體弱，以致脾胃虛弱，不能升清降濁谷反成滯，水反為濕，合污下降導致而成，本院自擬止瀉方重用黃芪、白術，取兩味藥在益氣升脾的基礎上促進脾胃運化，藥理研究證實黃芪具有增強機體免疫功能、抗菌作用。防風入脾經，質輕，可引導水谷之氣上升，山藥性平和，歸肺、脾、腎三經，主要功效為補脾止瀉，藥理研究顯示山藥可改善消化，調節自主神經，增強體質；遷延性腹瀉患兒由于久泄傷陽，予加干姜溫中澀腸止瀉；肉豆蔻，除寒燥濕，解結行氣，專理脾胃，能固及大腸之滑脫；甘草予調和諸藥藥性。諸藥合用，攘外安內，療效顯著。本研究顯示，觀察組患者Th17細胞表達頻率，IL-6、IL-17、IL-23細胞因子的表達水平顯著低于對照組，提示自擬止瀉方可能具有下調Th17細胞功能，改善慢性炎性反應的作用，該效應可能是自擬止瀉方從機體免疫方面改善遷延性腹瀉患兒的作用機制之一。

總之，遷延性腹瀉的發病機制與Th17細胞功能失調密切相關，而自擬止瀉方可以部分逆轉該疾病的發展，從而改善患者預后。考慮可能此次入選樣本量較小有關，隨訪時間不長等，故有待于增加樣本量，進一步擴大研究予以證實自擬止瀉方對于遷延性腹瀉的預后及確切機制，為指導臨床治療提供參考價值。

［1］Navaneethan U，Giannella RA.Mechanisms of infectious diarrhea［J］. Nature clinical practice Gastroenterology＆hepatology，2008，5（11）：637 -647.

［2］湯瀅，江國榮.玉屏風散不同方法提取物免疫增加效應的實驗研究進展［J］.安徽醫藥，2011，15（2）：141-143.

［3］程瑞朵，吳嵐，張榮，等.玉屏風散對遷延性腹瀉患兒的免疫調節作用［J］.中國免疫學雜志，2014，30（1）：61-63.

［4］徐培平，丁偉，趙昉，等.中藥預防流感作用與黏膜免疫相關性研究［J］.中國免疫學雜志，2012，28（11）：992-998.

［5］段如成.微生態調節劑在兒科消化系統疾病的作用［J］.中國微生態學雜志，2002，14（1）：1-2.

［6］萬盛華，羅紅，李香萍.培菲康聯合潔維樂治療小兒遷延性和慢性腹瀉［J］.中國微生態學雜志，2007，19（1）：88.

［7］朱孝琳.鋅制劑聯合布拉酵母菌治療小兒遷延性腹瀉療效觀察［J］.兒科藥學雜志，2014，20（1）：22-24.

［8］李旭光.小兒遷延性腹瀉臨床分析［J］.臨床醫學，2011，31（4）：93-94.

［9］石永生，王永軍，蔣成鵬，等.嬰幼兒遷延性腹瀉病發病及預后的高危因素［J］.中國婦幼保健，2011，26（5）：695-699.

［10］郭振鋒.嬰幼兒遷延性慢性腹瀉130例的臨床特點分析［J］.臨床和實驗醫學雜志，2010，9（18）：1413-1414.

［11］王秀麗，劉進生，方輝，等.嬰幼兒急性腹瀉病血鋅水平及補鋅治療的臨床觀察［J］.安徽醫學，2013，34（4）：434-436.

［12］曲輝，康凱，付姝麗，等.嬰幼兒腹瀉病血清硒水平的研究［J］.中國醫師進修雜志，2012，35（30）：12-14.

［13］應愛娟，江米足.鋅在兒童腹瀉治療中的作用［J］.國際兒科學雜志，2009，8（5）：535-537.

［14］王冬萌，畢晶，孫正纖.小兒遷延性腹瀉與鋅缺乏病發病關系研究［J］.中國全科醫學，2011，6（2）：196-197.

［15］江米足.慢性、難治性腹瀉病的診斷與治療進展［J］.實用兒科臨床雜志，2005，20（3）：201-203.

（2014-07-14收稿 責任編輯：徐穎）

Clinical Observation on Self-Made Antidiarrheal Decoction in Treating Pediatric Protracted Diarrhea by Regulating Th17 Cell Function

Zhang Xianwei，Sun Hang
（Laboratory，Nanjing Children's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China）

Objective：To observe the clinical curative effect of self-made antidiarrheal decoction in the treatment of pediatric protracted diarrhea and some of its regulatory mechanism.Methods：One hundred cases of pediatric protracted diarrhea treated in our hospital during March 2010 to March 2013 were included in the study.Fifty cases in the control group accepted medical conventional treatment，and the other 50 cases in the observation group received self-made antidiarrheal decoction apart from the same treatment of the control group. The treatment course of both groups was 10 days.The symptoms changes of children in the two groups after treatment was observed.Simultaneously flow cytometry was used to test peripheral blood expression level of Th17 cells，and ELISA was used to detect the protein expression level of IL-6，IL-17，IL-23 in the serum of patients.Results：1）Temperature recovery time，vomiting stop time of the two groups were with no statistical differences（P＞0.05），but the diarrhea stop time of the observation group was shorter than that of the control group（P＜0.05）.2）after treatment，serum IL-6，IL-17，IL-23 levels in children in the two groups with lower than those before treatment（P＜0.05），and after one period of treatment，IL-17，IL-6，IL-23 levels of the observation group declined significantly than those of the control group（P＜0.01）.3）after the 3months follow-up，children's weight gain of the observation group was obviously more than that of the control group（P＜0.05）.Conclusion：Children with protracted diarrhea have increased expression of Thl7 cells and hyperfunction，and self-made antidiarrheal decoction can obviously down-regulate frequency and function of Thl7 cells expression which may be one of the mechanisms of self-made antidiarrheal decoction improving protracted diarrhea in the aspects of the body's immune ability.

Protracted diarrhea；Self-made antidiarrheal decoction；Th17 cells；IL-6；IL-17；IL-23

R285.6

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.014

浙江省醫藥衛生科技計劃立項（編號：2011KYB142）