抗血小板治療對老年人血小板功能的影響及其環氧化酶1和環氧化酶2基因多態性研究

梁 輝，黃潔杰，周熙琳，王文安

血栓性疾病包括動脈血栓和靜脈血栓，是老年性疾病的病因之首及病死的重要原因。老年人容易出現血栓栓塞的原因是動脈發生粥樣硬化及斑塊脫落、血小板活化及血小板血栓形成，易導致心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件。抗血小板治療可減少心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件，但“藥物抵抗”常影響抗血小板治療療效。本研究選取具有血栓高危因素(如患有糖尿病、高脂血癥、高血壓等)或發生過動脈血栓事件(如腦梗死、心肌梗死等)而進行抗血小板治療的老年患者為研究對象，檢測其血小板功能及環氧化酶1(COX-1)、環氧化酶2(COX-2)基因多態性(SNP)，以期為臨床抗血小板治療提供個體化干預指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月—2012年12月在上海交通大學附屬新華醫院住院的≥60歲且服用拜阿司匹林1年以上的患者114例，其中具有血栓高危因素者55例(高危組)，發生過動脈血栓事件者59例(血栓組)。高危組中男34例，女21例；年齡60～88歲；糖尿病19例，高脂血癥伴高血壓36例。血栓組中男36例，女23例；年齡61～85歲；單純性腦梗死22例、腔隙性腦梗死37例，單純性腦梗死和腔隙性腦梗死的診斷參照各類腦血管病診斷要點[1]；糖尿病25例，高脂血癥伴高血壓34例。另選取同期在本院行體檢健康者55例為對照組，其中男35例，女20例；年齡60～82歲；均無糖尿病、高脂血癥或高血壓，且從未服用過拜阿司匹林。3組受試者的性別、年齡具有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 血小板計數(PLT)和血小板平均體積(MPV) 采用LH750全自動血液分析儀測定3組受試者PLT和MPV。

1.2.2 血栓彈力圖(TEG) 抽取每例受試者空腹靜脈血6 ml，其中3 ml用肝素抗凝，3 ml用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，在2 h內嚴格按照說明書進行TEG檢查，所用儀器為美國Haemoscope Corp公司TEG-5000血栓彈力儀，測定出血栓最大幅度后再描記30 min后停機；記錄血栓最大堅固度(TEG-MA)和花生四烯酸誘導的血小板抑制率(TEG-AA)。前者與血小板質、量和纖維蛋白原水平有關，花生四烯酸(AA)購自Chronolog公司，濃度為0.5 mg/L。TEG-AA≤20%為阿司匹林抵抗(AR)，20%

1.2.3 SNP 抽取每例受試者全血300 μl，按血液Wizard基因組DNA純化試劑盒(promega公司生產)說明書提取基因組DNA，在260 nm、280 nm紫外分光光度儀下檢測DNA吸光度，進行濃度和純度鑒定；PCR反應引物序列見表1。采用50 μl反應體系進行PCR擴增：DNA模版1.0 μl、上游引物和下游引物各1.0 μl、10 mmol/L dNTP 1.0 μl、去離子水36.3 μl、Taq酶2.5 μl、緩沖液5.0 μl；反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s、55～60 ℃ 35 s、72 ℃ 40～50 s，共35個循環，72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 PCR反應引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

注：COX-1=環氧化酶1，COX-2=環氧化酶2

2 結果

2.1 PLT、MPV和TEG-MA 3組受試者PLT比較，差異無統計學意義(P>0.05)；3組受試者MPV、TEG-MA比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中血栓組MPV、TEG-MA均大于高危組和對照組，高危組TEG-MA大于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 3組受試者PLT、MPV和TEG-MA比較Table 2 Comparison of PLT，MPV and TEG-MA in the three groups

注：PLT=血小板計數，MPV=血小板平均體積，TEG-MA=血栓最大堅固度；與對照組比較，*P<0.05；與高危組比較，△P<0.05

2.2 TEG-AA 對照組AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA為(78.7±15.0)%；高危組AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA為(64.2±23.7)%；血栓組AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA為(32.5±19.4)%。3組受試者TEG-AA比較，差異有統計學意義(F=86.250，P<0.05)；且血栓組低于高危組，高危組低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3 SNP檢測結果

2.3.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 根據TEG-AA將所有受試者分為NAS組66例和AS組103例，Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點和COX-2基因-765 G>C位點SNP具有群體代表性。PCR擴增產物直接測序結果見圖1～2。

2.3.2 COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因分布 NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.3.3 COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因分布 NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表4)。

注：A為野生型AA基因型，B為雜合子AG基因型，C為突變純合子GG基因型；顏色加深處為SNP位點

圖1 COX-1基因-1676A>G位點PCR擴增產物直接測序結果

Figure1 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-1-1676A>G

注：A為野生型GG基因型，B為雜合子GC基因型；顏色加深處為SNP位點

圖2 COX-2基因-765G>C位點PCR擴增產物直接測序結果

Figure2 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-2-765G>C

表3 NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table3 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-1-1676A>G between NAS group and AS group

組別例數基因型AA AG GG等位基因A GNAS組6613(19 7)40(60 6)13(19 7) 66(50 0) 66(50 0)AS組10340(38 8)53(51 5)10(9 7)133(64 6)73(35 4)χ2值8 2587 047P值0 0160 008

表4 NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table4 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-2-765 G>C between NAS group and AS group

組別例數基因型GG CG等位基因G CNAS組6658(87 9)8(12 1)124(93 9)8(6 1)AS組10398(95 1)5(4 9)201(97 6)5(2 4)χ2值2 9922 872P值0 0840 090

3 討論

老年人血栓形成的幾率是兒童和青少年的數百倍至一千倍，早期預防和早期干預尤為重要[3]。老年人容易出現血栓的原因是由于動脈粥樣硬化及斑塊脫落而造成血管內皮細胞下膠原暴露、血小板活化，最后形成血小板血栓，繼而導致心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件[4]。抗血小板藥物用于治療動脈粥樣硬化斑塊造成的血栓已有幾十年的歷史，最常用藥物為阻斷AA途徑的阿司匹林。研究表明，阿司匹林用于高危心腦血管疾病患者可分別使動脈血栓事件發生率(心肌梗死或腦梗死)降低25%，冠狀動脈旁路移植術及動脈栓塞事件發生率降低48%，肺栓塞發生率降低67%，深靜脈血栓形成發生率降低23%[5]。但研究者在實際臨床工作中發現，固定劑量的阿司匹林隨著用藥時間的推移有些個體可出現AR現象，導致“再梗”，且多見于年齡偏大患者[6]。如何預測服用阿司匹林患者是否出現AR及哪些因素容易引起AR是臨床醫生關注的重要問題。因此，本研究選取具有血栓高危因素或發生過動脈血栓事件而進行抗血小板治療的老年患者為研究對象，檢測其血小板功能及COX-1、COX-2的SNP，以了解AR情況，決定是否需要更改治療方案，為臨床抗血小板治療提供個體化干預指導。

機體在正常情況下，血管內血小板處于循環狀態，但在血栓形成的過程中，由于血管內皮損傷、內皮下膠原纖維暴露而導致流經此處的血小板黏附、聚集、激活，血小板不斷消耗，PLT相應地減少，同時血液系統通過反饋機制激活巨核細胞，產生大體積血小板，MPV相應地增大。大體積血小板致密顆粒多、酶活力高、功能活躍、聚集及黏附能力增強，容易導致血栓形成[7]。因此，PLT是反映血小板生成與衰老的指標，MPV是反映巨核細胞增生和血小板生成的指標。TEG-MA是反映PLT和纖維蛋白原相互作用的指標，其中PLT的作用約占80%，因此TEG-MA主要反映血小板的聚集功能[8]。本研究結果顯示，3組受試者PLT無明顯差異，血栓組MPV、TEG-MA均大于高危組和對照組，高危組TEG-MA大于對照組，提示具有血栓高危因素或發生過動脈血栓事件而進行抗血小板治療的老年患者巨核細胞被激活，產生了大體積血小板，導致血小板聚集、黏附能力增強。本研究通過計算TEG-AA發現，對照組AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA為(78.7±15.0)%；高危組AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA為(64.2±23.7)%；血栓組AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA為(32.5±19.4)%。血栓組TEG-AA低于高危組，高危組TEG-AA低于對照組。提示具有高危血栓因素或發生過動脈血栓事件而進行抗血小板治療的老年患者存在AR現象，需要調整抗血小板治療方案以預防突發性動脈血栓事件，而采用阿司匹林抗血小板治療仍有發生動脈血栓事件的可能，這部分患者應判為“阿司匹林治療失敗”。心腦血管疾病的發生、發展是多種危險因素共同作用的結果，在血栓形成過程中，血小板活性增強是重要因素，但不是惟一因素，凝血因子的活化也是血液呈高凝狀態的重要原因。Kulshrestha等[9]研究表明，腦血管疾病的發生與高血壓、糖尿病等密切相關，血小板的數量、質量、形態改變與凝血因子的活化密切相關。

本研究根據TEG-AA將所有受試者分為NAS組66例和AS組103例，探討老年人COX-1和COX-2的SNP。研究結果顯示，NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率間均有明顯差異，而NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率均無明顯差異。COX-1存在于大多數組織細胞中，是AA轉化為前列腺素G和前列腺素H途徑的第一個酶，阿司匹林通過使COX-1絲氨酸530位不可逆地乙酰化而阻斷血栓素A2(TXA2)的合成，進而發揮抗血栓作用。目前國內外關于COX-1 SNP的研究主要集中于-842A>G、50C>T、22C>T、644C>A位點等。Fan等[10]研究首次證實COX-1基因-1676A>G位點SNP與中國漢族老年人群AR相關，本研究結果與之一致，證明了COX-1基因-1676A>G多位點SNP與老年人AR相關。機體在正常情況下，COX-2只在部分細胞低表達，只有受到炎癥等刺激后才會在平滑肌細胞、內皮細胞和血小板中表達增加。阿司匹林對COX-1的抑制作用較COX-2約強170倍，COX-2可能是AR的另一個重要原因[11]。研究表明,COX-2基因-765 G>C位點中攜帶C等位基因者更易發生AR，AR患者COX-2基因-765G>C位點基因變異率較AS患者明顯升高[12-13]，但也有研究表明COX-2基因-765G>C位點SNP與AR無關[14-15]，本研究亦未發現COX-2基因-765G>C位點SNP與AR之間的相關性，分析其原因可能與地區和種族差異有關。

綜上所述，血小板活性增強是血栓形成的重要原因，具有高危血栓因素或發生過動脈血栓事件而進行抗血小板治療的老年患者存在AR現象，需注意調整抗血小板治療方案；COX-1基因-1676A>G位點SNP可能與AR有關，COX-2基因-765G>C位點SNP可能與AR無關。

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