潰瘍性結腸炎的微生態學改變及雙歧桿菌的治療作用研究

邱春雷，嚴 紅，吳雄健，劉洪榮

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以結腸黏膜彌漫性炎性損害為主要病理特征的消化系統疾病，是一種多因素、病因不清的慢性非特異性炎癥性腸道疾病[1]。患者常出現腹痛、腹瀉、血便等臨床癥狀，個別患者有時出現貧血或急劇疼痛，發病年齡為20～50歲。國內外流行病學調查結果顯示，UC發病率和死亡率均呈明顯上升趨勢，嚴重威脅人們的生命健康，已被WHO列為現代難治病之一。至今為止，UC的病因和發病機制尚未明確，盡管對其治療做了很多研究，但仍未取得滿意療效和突破性進展[2]。大量研究證實，菌群與UC關系密切，腸道菌群失調被認為是UC發生的重要原因之一[3]；實驗研究和臨床研究均證明腸道益生菌可改善UC患者菌群失調和自身免疫功能，從而緩解或消除腸道炎癥[4-5]。本研究通過檢測活動期UC(active ulcerative colitis，AUC)和緩解期UC(remissive ulcerative colitis，RUC)患者糞便菌群，觀察其微生態學改變及雙歧桿菌對UC的治療作用，探討UC發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年5月—2013年3月在井岡山大學附屬醫院門診就診或住院的AUC患者64例(AUC組)和RUC患者71例(RUC組)，病程3個月～20年；另選取同期在本院體檢健康者30例(對照組)，半年內均未服用過抗生素。AUC組中男33例、女31例，年齡21～57歲；RUC組中男38例、女33例，年齡20～59歲；對照組中男15例、女15例，年齡21～55歲。UC的診斷符合2007年中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組頒布的“對我國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見”中的診斷標準。患者或其監護人、對照者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌、擬桿菌、普雷沃氏菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、腸球菌、柱狀真桿菌和普拉梭菌16SrDNA基因序列[6]，利用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計PCR引物。引物序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 腸道菌群16SrDNA基因特異性引物序列

Table1 Species-specific primers sequence of 16SrDNA gene of bacterial group

腸道菌群上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)退火溫度(℃)長度(bp)雙歧桿菌CTCCTGGAAACGGGTGGTGCTGCCTCCCGTAGGAGT55168乳酸桿菌AGCAGTAGGGAATCTTCCACACCGCTACACATGGAG50267大腸埃希菌CATGCCGCGTGTATGAAGAACGGGTAACGTCAATGAGCAAA5276擬桿菌GGTTCTGAGAGGAGGTCCCGCTGCCTCCCGTAGGAGT5558普雷沃氏菌CAGCAGCCGCGGTAATAGGCATCCATCGTTTACCGT50245球形梭菌ACTCCTACGGGAGGCAGCGCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT55206柔嫩梭菌GTTGACAAAACGGAGGAAGGGACGGGCGGTGTGTACAA53213腸球菌CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATACTCGTTGTACTTCCCATTGT51132柱狀真桿菌ACTCCTACGGGAGGCAGCCATTGCTCGTTCAGGGTTC5384普拉梭菌CAGCAGCCGCGGTAAACTACCTCTGCACTACTCAAGAAA52116通用引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTATTACCGCGGCTGCTGGC56174

1.2.2 腸道菌群培養 稱取所有受試者新鮮糞便，按1∶10比例加入磷酸鹽緩沖液(PBS)進行稀釋，震蕩后充分混勻，需氧菌稀釋度為107～108，厭氧菌稀釋度為108～109。采用不同的選擇性培養基進行培養，每個平板均勻涂布50 μl稀釋液，每種菌群涂布3個平板。雙歧桿菌采用BBL瓊脂，乳酸桿菌采用Lbs瓊脂，大腸埃希菌和普雷沃氏菌采用伊紅美藍瓊脂，擬桿菌采用膽汁-七葉甙(BBE)瓊脂，球形梭菌、柔嫩梭菌和普拉梭菌采用哥倫比亞瓊脂，腸球菌采用疊氮鈉-結晶紫七葉苷瓊脂，柱狀真桿菌采用ES瓊脂。需氧菌培養18～24 h，厭氧菌培養48～72 h，計算同一稀釋度下平均菌落數，以lg n/g表示。

1.2.3 糞便細菌DNA提取 參照《分子克隆操作指南》和文獻[7]介紹的方法加以改良：收集所有受試者糞便標本，取1 g糞便加0.01 M的PBS 9 ml，充分顛倒混勻后以1 000 r/min低速離心5 min，離心半徑為10 cm，取上清液，上述過程重復3次，收集上清液以14 000 r/min高速離心10 min后取沉淀，離心半徑為10 cm，反復用PBS洗滌3次，水洗1次，沉淀即為糞便總細菌。按細菌基因組DNA快速提取試劑盒的操作說明提取總細菌DNA并檢測其濃度，-20 ℃冰箱保存備用。標準菌株37 ℃搖床200 r/min培養過夜，離心半徑為10 cm，次日收集菌體并按細菌基因組DNA快速提取試劑盒的操作說明提取細菌DNA。

1.2.4 常規PCR與熒光定量PCR 采用長雙歧桿菌CICC6068、嗜酸乳桿菌CICC6088、大腸埃希菌ACCC11864、糞腸球菌ACCC10699、擬桿菌CICC10402、普雷沃氏菌ATCC25845、柔嫩梭菌ATCC29065、普拉梭菌ATCC27766、柱狀真桿菌ATCC27803、球形梭菌ATCC29236標準菌株進行常規PCR擴增。50 μl反應體系為：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，模板5 μl，上、下游引物各1 μl，石蠟20 μl，補充滅菌超純水至50 μl。擴增參數：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s、退火(溫度見表1)30 s、72 ℃延伸30 s(共30個循環)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

將上述標準菌株擴增產物回收、純化，作為制作熒光定量PCR標準曲線的標準品。標準品和待測樣品DNA進行16SrDNA熒光定量PCR反應。25 μl反應體系為：2×SYBR?Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，50×ROX Reference DyeⅡ 1 μl，DNA模板2 μl，補充滅菌超純水至25 μl。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、退火(溫度見表1)34 s、72 ℃延伸30 s(共40個循環)72 ℃延伸10 min，95 ℃變性15 s、退火(溫度見表1)1 min、72 ℃延伸30 s，循環1次得到溶解曲線。

1.2.5 治療方法及療效判斷標準 將AUC組患者按隨機數字表法分為AUC1組32例和AUC2組32例，RUC組患者按隨機數字表法分為RUC1組36例和RUC2組35例，AUC1組和RUC1組患者口服諾氟沙星膠囊(氟哌酸膠囊)，3粒/次，2次/d；AUC2組和RUC2組口服雙歧桿菌活菌膠囊(麗珠腸樂膠囊)，2粒/次，3次/d。4個亞組治療療程均為1個月，同時口服柳氮磺胺吡啶片，1.0 g/次，4次/d。療效判斷標準：(1)臨床療效：①顯效：排便恢復正常，無腹痛現象；②有效：糞便顏色正常，腹痛減輕、偶爾腹瀉；③無效：癥狀無變化。(2)組織學療效：①顯效：腸鏡下可見黏膜輕度充血、潰瘍較前縮小或基本消失，病理切片可見黏膜細胞和腺體基本正常，炎性細胞明顯減少；②有效：腸鏡下可見黏膜部分充血、水腫減輕，部分腸黏膜組織接近正常，病變范圍較前縮小，病理切片可見黏膜細胞部分修復，有少量炎性細胞；③無效：腸鏡及病理切片觀察與治療前相比無變化。

1.2.6 分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量檢測 稱取所有受試者新鮮糞便，按1∶2加入0.01 M的PBS，震蕩后充分混勻，12 000 r/min低溫離心30 min，離心半徑為10 cm，取上清液，按照sIgA放射免疫分析試劑盒說明書，采用放射免疫分析法測定sIgA含量，操作步驟如下：取100 μl上清液，依次加入100 μl125I-sIgA和100 μl sIgA抗體，充分混勻，37 ℃水浴60 min，加入二抗混勻，37 ℃水浴30 min，4 ℃放置10 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm，棄上清液，取沉淀在液體閃爍計數儀上計數，根據標準曲線計算樣本中sIgA含量。

1.2.7 線粒體膜蛋白(Apo-2.7)含量檢測 用活檢鉗取UC患者結腸潰瘍邊緣新鮮組織及對照者正常結腸組織0.5～1.0 g，剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm小碎塊，于200目網篩研磨，然后用PBS沖洗，濾液以1 500 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，PBS沖洗2次，1 000 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，棄上清液；調整細胞數至109/ml，加入20 μl Apo-2.7-PE，室溫避光反應30 min。采用流式細胞儀收集10 000個細胞，測定光散射數并計算樣本中Apo-2.7含量。

2 結果

2.1 腸道菌群菌落數 腸道菌群16SrDNA基因特異性引物分析：每對引物均只能擴增出一條片段，未出現非特異性條帶，片段長度與預期一致(見圖1)，可以用于后續熒光定量PCR反應。3組受試者普雷沃氏菌、柱狀真桿菌菌落數比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌、擬桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、腸球菌、普拉梭菌及總細菌菌落數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，AUC組和RUC組雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及總細菌菌落數減少(P<0.05)，大腸埃希菌、腸球菌菌落數增加(P<0.05)；與RUC組相比，AUC組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數減少(P<0.05)，大腸埃希菌菌落數增加(P<0.05,見表2)。

2.2 臨床療效和組織學療效 4個亞組患者在治療過程中均未出現明顯不良反應。AUC2組臨床療效和組織學療效均優于AUC1組(u值分別為96.000和128.000，P<0.05)；RUC2組臨床療效和組織學療效均優于RUC1組(u值分別為72.000和144.000，P<0.05，見表3)。

注：1為腸球菌，2為雙歧桿菌，3為大腸埃希菌，4為柔嫩梭菌，5為通用引物，6為柱狀真桿菌，7為普拉梭菌，8為球形梭菌，9為擬桿菌，10為乳酸桿菌，11為普雷沃氏菌

圖1 腸道菌群16SrDNA基因特異性引物PCR擴增結果

Figure1 PCR result of species-specific primers of 16SrDNA gene of bacterial group

2.3 4個亞組治療后腸道菌群菌落數比較 治療后，AUC2組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數較AUC1組增加，大腸埃希菌菌落數較AUC1組減少(P<0.05)；RUC2組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數較RUC1組增加，大腸埃希菌菌落數較RUC1組減少(P<0.05)；AUC2組與AUC1組、RUC2組與RUC1組其他腸道菌群及總細菌菌落數比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表4～5)。

表3 4個亞組患者臨床療效和組織學療效比較(例)

Table3 Comparison of clinical efficacy and histological efficacy in the four subgroups

組別例數臨床療效顯效 有效 無效組織學療效顯效 有效 無效AUC1組326141251314AUC2組321316310184RUC1組361861214715RUC2組352211211204

2.4 sIgA含量與Apo-2.7含量 對照組與AUC1組、RUC1組sIgA、Apo-2.7含量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；AUC2組sIgA含量高于AUC1組，Apo-2.7含量低于AUC1組，差異均有統計學意義(P<0.05)；RUC2組sIgA含量高于RUC1組，Apo-2.7含量低于RUC1組，差異均有統計學意義(P<0.05)；AUC2組和RUC2組sIgA、Apo-2.7含量與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表6)。

表2 3組受試者腸道菌群菌落數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與RUC組比較，△P<0.05

表4 AUC1組和AUC2組治療后腸道菌群菌落數比較

表5 RUC1組和RUC2組治療后腸道菌群菌落數比較

Table6 Comparison of sIgA and Apo-2.7 levels in control group and the four subgroups

組別例數sIgA(μg/g)Apo-27(%)對照組30138088±11101243±033AUC1組32103107±8842?1147±222?AUC2組32135175±8852△258±064△RUC1組36116860±10145?708±113?RUC2組35139873±11080▲305±035▲F值10558252840P值00000153

注：與對照組比較，*P<0.05；與AUC1組比較，△P<0.05；與RUC1組比較，▲P<0.05；sIgA=分泌型免疫球蛋白A，Apo-2.7=線粒體膜蛋白

3 討論

UC是一種病因和發病機制不明的復雜慢性炎癥性腸病，主要病變表現為結腸黏膜炎癥或潰瘍，一般自遠端結腸逆行至近端結腸，嚴重時可遍及整個結腸或累及直腸[8]。UC在發達國家相當常見，而在我國該病極少見，但近20年來UC在我國呈不斷上升趨勢，盡管對UC病因進行了大量研究，但至今仍未取得突破性進展。一般認為，UC與感染、機體免疫、黏膜免疫、腸道微生物、細胞因子、氧自由基、神經內分泌和遺傳等有關，機體菌群失調是UC的重要病因之一。微生態學研究顯示，在正常生理狀態下，定居于腸道的細菌種類達500多種，約為1 012 CFU/g，且主要集中于結腸和末端小腸；雙歧桿菌屬、類桿菌屬、乳酸菌屬等專性厭氧菌是腸道菌群的生理性優勢菌，約占腸道總菌量的99%，其余1%主要是腸桿菌、腸球菌屬等兼性厭氧性條件致病菌和變形桿菌、假單胞菌等過路病原菌[9]。正常情況下，絕大多數腸道菌群對人體是有益的，能相互依存、相互制約，使得腸道微生態保持平衡狀態。但這些潛在的致病菌一旦被外界因素激發，平衡被打破，引起腸道微生態失調即可造成炎癥，外界因素包括抗生素、細胞毒性藥物、激素、免疫抑制劑等化學因素以及射線、手術、創傷等物理因素。眾多臨床研究表明，UC患者發病和復發與腸道菌群改變密切相關，腸道細菌及其產物等可作為抗原誘導某些具有遺傳易患性的個體腸道黏膜免疫功能失衡，使腸道免疫系統對腸道抗原耐受性減退甚至消失，進而引發腸道炎癥[10]。本研究結果顯示，與健康對照者相比，無論是AUC患者還是RUC患者，其腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及總細菌菌落數均有不同程度減少，大腸埃希菌和腸球菌菌落數增加；與RUC患者相比，AUC患者雙歧桿菌和乳酸桿菌菌落數減少，而大腸埃希菌菌落數增加。

近年研究表明，使用益生菌調理腸道微生態能夠預防和控制UC[11-12]。目前臨床上常用的益生菌制劑主要有：雙歧桿菌活菌制劑(麗珠腸樂、回春生)，雙歧桿菌三聯活菌制劑(培菲康、金雙歧、貝飛達)，枯草桿菌和糞球菌二聯活菌制劑(美常安)，蠟樣芽孢桿菌活菌制劑(促菌生)，地衣芽孢桿菌活菌制劑(整腸生)等。雙歧桿菌是革蘭陽性無芽孢厭氧桿菌，具有抗感染、抗腫瘤、抗衰老、免疫賦活、促消化等作用，對維持人體健康至關重要，臨床研究也觀察到雙歧桿菌制劑防治腸道感染具有理想效果。本研究在柳氮磺胺吡啶治療的基礎上采用雙歧桿菌活菌制劑麗珠腸樂對UC患者進行治療，并與氟哌酸進行對照，結果顯示，治療后AUC2組、RUC2組雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數分別較AUC1組、RUC1組增加，大腸埃希菌菌落數分別較AUC1組、RUC1組減少；AUC2組、RUC2組臨床療效和組織學療效分別優于AUC1組、RUC1組，且4個亞組患者在治療過程中均未出現明顯不良反應。雖然目前雙歧桿菌治療UC的作用機制尚未完全闡明，但一般認為雙歧桿菌可調節腸道菌群平衡，發揮多種生物拮抗功能，如通過營養爭奪、產生酸性代謝產物、降低腸道局部pH值等而產生對腸道功能有重要作用的營養物質和廣譜抗菌物質，如親脂分子、細菌素、過氧化氫等，抑制或殺滅腸道大腸埃希菌、沙門氏菌、鏈球菌等致病菌。此外，雙歧桿菌還可通過磷壁酸黏附作用而緊密結合在腸上皮細胞表面，形成一層菌膜屏障，阻止腸道內源性及外源性潛在致病菌易位、入侵和定植；促進抗炎細胞因子和抑制促炎細胞因子的分泌；增強先天性免疫細胞的吞噬功能。目前，關于益生菌灌腸療法治療UC的臨床研究報道極少，還有待于進一步研究以闡明益生菌防治UC的機制。

正常機體血清中IgA含量僅次于IgG，按其免疫功能可分為血清型和分泌型，sIgA由黏膜相關淋巴結產生[13]，是機體黏膜免疫系統的最重要因子，主要分布于鼻、咽、氣管、胃腸道和泌尿生殖道分泌液中，能抵抗微生物在黏膜上皮附著，減緩病毒繁殖，是防止病原體入侵機體的第一道防線[14]。外來抗原進入呼吸道或胃腸道，局部免疫系統受到刺激后，其無需中樞免疫系統參與就可以自行進行免疫應答，產生sIgA，sIgA含量變化直接反映機體黏膜局部免疫狀態。腸黏膜功能活躍，但十分容易受損，缺血、缺氧、氧化應激、酸中毒、腸道菌群失調以及炎性細胞因子刺激等均可損害腸黏膜免疫功能，腸道生化內環境改變可導致sIgA分泌減少，而sIgA作為腸黏膜免疫的重要組成部分和效應分子，其合成和分泌減少勢必會削弱腸道免疫功能。王旭霞等[15]研究表明，sIgA含量變化與UC的發生密切相關；本研究結果亦顯示，UC患者sIgA含量與健康對照者存在明顯差異，提示UC患者腸道黏膜免疫功能存在不同程度地降低，雙歧桿菌治療有助于改善腸道黏膜免疫功能。國內外研究表明，腸道損傷、雙歧桿菌顯著減少可能導致sIgA合成和分泌減少，而補充雙歧桿菌可降低血漿內毒素和IL-6水平，維持機體促炎、抗炎反應平衡，進而促進IL-4介導的sIgA的合成與分泌[16]。

細胞凋亡是一種受基因調控的自主性細胞程序性死亡過程，細胞發生凋亡時，常伴有凋亡調控基因表達的級聯反應變化。Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Apo、caspase等均參與了細胞凋亡過程。越來越多的研究表明，UC患者存在腸黏膜上皮細胞過度凋亡、黏膜固有層淋巴細胞抵抗凋亡以及中性粒細胞(PMN)凋亡遲滯，是造成UC患者腸道炎癥發生和持續的重要原因[17]。Apo-2.7是一個大小為38 kDa的膜蛋白，是細胞凋亡的特異標志物。為了維持結腸黏膜屏障的動態平衡，正常機體結腸上皮黏膜細胞可表達低水平Apo-2.7用于調控衰老細胞凋亡，臨床常用Apo-2.7判斷黏膜病變損傷程度及病情活動度[18]。本研究結果顯示，UC患者Apo-2.7含量與健康對照者存在明顯差異，提示結腸黏膜上皮細胞凋亡增加可引起腸黏膜損傷，繼而發生潰瘍，雙歧桿菌治療有助于抑制結腸黏膜上皮細胞的凋亡。

總之，UC患者腸道共生菌數量減少，條件致病菌增加，雙歧桿菌活菌制劑治療UC療效顯著，UC發病可能與機體菌群失調、腸道免疫功能破壞及結腸黏膜上皮細胞過度凋亡有關。但本研究樣本量較小，限于當前的研究水平，本研究所得結論仍存在較大局限性，雙歧桿菌治療UC的臨床療效和UC的發病機制還有待進行更多的臨床研究觀察和分析。

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