不同劑量瘦素對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響研究

余 帆，徐彤彤，佐 妍，呂祥威

糖尿病作為臨床上一種常見的慢性代謝性疾病，其發病率已隨著人們生活水平的提高而逐年增加。糖尿病常伴發或并發各種心血管疾病，譬如心肌缺血、心肌梗死及猝死[1-2]。這一高危因素，已逐漸引起學者重視。近年來瘦素與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)在心血管疾病中的作用備受關注[3-4]，目前國內就兩者在糖尿病并發心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)過程中的相關作用報道較少。本研究旨在通過復制糖尿病大鼠MIRI模型，觀察不同劑量外源性瘦素預處理對大鼠血清瘦素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及胰島素抵抗指數(HOMA-IR)的影響，探討瘦素預處理在糖尿病大鼠MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 (1)實驗動物：清潔級SPF雄性SD成年健康大鼠60只，8周齡，體質量170～190 g，由桂林醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK 桂 2013-0001。動物飼養條件：室溫18～25 ℃，相對濕度50%～80%的環境下，每天日照時間為8:00-20:00。(2)主要藥品和試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，100 mg，美國sigma公司 S0130)，重組瘦素(200 μg,Leptin，美國R&D Systems公司)，MDA、TNF-α酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(均為100管/96T，南京建成生物工程研究所)，瘦素放射免疫分析盒(100管/96T，中國原子能科學研究所)，125I-胰島素放射免疫分析藥盒(100管/盒，北京科美生物技術有限公司)。(3)主要儀器：血糖儀(羅氏，卓越型)、小型動物呼吸機、Leica顯微鏡、超聲勻漿機、高速離心機、電子秤和BECKMAN全自動生化分析儀。

1.2 飼料 普通飼料由醫學院動物實驗中心提供。高糖高脂飼料配方為每100.0 g飼料中含標準飼料粉25.5 g、酵母粉0.5 g、大豆粉10.0 g、食鹽0.5 g、豬油15.0 g、蔗糖20.0 g、奶粉10.0 g、麻油5.0 g、蛋黃粉10.0 g、花生10.0 g。將上述配料充分混勻，烤熟壓制成形后喂養，此飼料喂養前臨時配制。

1.3 分組方法及模型制備 (1)60只健康大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、糖尿病假手術組、糖尿病假手術心肌梗死模型組(心肌梗死組)、糖尿病心肌梗死低劑量瘦素預處理組(低劑量組)、糖尿病心肌梗死中劑量瘦素預處理組(中劑量組)、糖尿病心肌梗死高劑量瘦素預處理組(高劑量組)，每組各10只。正常對照組采用普通飼料喂養4周，而糖尿病5組均采用高糖高脂喂養4周后，禁食12 h腹腔注射STZ(STZ溶于pH值4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)35 mg/kg，注射藥物72 h后大鼠尾靜脈采血測定血糖，以隨機血糖>16.7 mmol/L且持續1周為造模成功。各組大鼠在術前均禁食10 h。(2)大鼠心肌梗死模型的制備采用結扎大鼠冠狀動脈左前降支。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，切開頸部正中皮膚，鈍性分離肌肉至氣管。氣管插管接小型動物呼吸機(呼吸頻率為72次/min)。大鼠冠狀動脈左前降支開胸結扎：在胸骨左側2～3 mm處切開皮膚，皮下鈍性分離，暴露心臟，鈍形分離第二肋間隙肋間肌。小心暴露心臟，剪開心包膜，用0.9%氯化鈉溶液沾濕的棉簽輕壓心臟。以無創小圓針進針(5-0絲線)在左心耳下緣內側1～2 mm處，深度約為1 mm，經由肺動脈圓錐右上方出針，留線墊置硅膠管。心肌梗死成功標志為：直視下可見被結扎血管供應區心肌變為蒼白色或腫脹。缺血30 min后松開線結，開放血管再灌注，縫線保留。糖尿病假手術組不結扎冠狀動脈前降支，僅留線。(3)正常對照組空腹取血清及心臟標本。糖尿病各組均在心肌梗死手術后3 h取大鼠血清及心臟標本，測定大鼠血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、瘦素、HOMA-IR、TNF-α、MDA及血脂水平。

1.4 標本制作 術后3 h大鼠腹腔靜脈取血5 ml，搖勻，抗凝，4 ℃，1 000 r/min低溫離心8 min(離心半徑10 cm)，分離血清置于-70 ℃冰箱保存待測。大鼠左心室心底部取心肌，50 mg心肌放入0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液中，用超聲勻漿機液氮低溫狀態下制備心肌勻漿。取大鼠左心室前壁肌組織，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌細胞形態學。

1.5 實驗室指標測定 采用靜脈葡萄糖氧化酶法測定隨機血糖、FBG；采用放射免疫法測定FINS和瘦素；采用ELISA測定血清TNF-α；采用HPLC法測定MDA；使用BECKMAN全自動生化分析儀檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG、FINS、瘦素水平、HOMA-IR比較 與正常對照組相比，糖尿病假手術組、心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與糖尿病假手術相比，心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FBG及瘦素水平均升高，心肌梗死組、高劑量組大鼠FINS及HOMA-IR均升高，低劑量組、中劑量組大鼠FINS及HOMA-IR均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與心肌梗死組相比，低劑量組、中劑量組FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 各組大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比較 與正常對照組相比，糖尿病假手術組、心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與糖尿病假手術組相比，心肌梗死組大鼠TNF-α、MDA水平升高，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠TNF-α、MDA、HDL-C水平升高，而TG、TC、LDL-C水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與心肌梗死組相比，低劑量組、中劑量組大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均降低，HDL-C水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 心肌組織病理學結果 病理學顯示，與正常對照組相比，糖尿病假手術組心肌細胞肥大、變形，部分心肌纖維排列紊亂，局部壞死，有中性粒細胞聚集現象；心肌梗死組心肌纖維排列紊亂，呈不規則分布，細胞結構依稀可見，心肌呈片狀局灶性壞死、出血，并有大量中性粒細胞聚集；中劑量組心肌細胞肥大、心肌組織結構紊亂，出血壞死灶與中性粒細胞聚集明顯減少，病變明顯改善；低劑量組病變有相同改善，但程度遠不及中劑量組；高劑量組心肌細胞肥大、心肌組織結構紊亂、細胞形態依稀可見，出血壞死灶及中性粒細胞聚集情況改變不明顯(見圖1)。

3 討論

糖尿病相關死亡病因中心血管并發癥占據大部分，其中又以缺血性心臟病為主[5-6]。糖尿病患者心力衰竭、再次心肌梗死的發生率及病死率都是非糖尿病患者的數倍。MIRI發病機制十分復雜，研究表明炎性因子浸潤、氧自由基增多、細胞內鈣超載等與其密切相關，在心肌細胞缺血糾正后可發生超微結構不可逆性壞死等[7]。而糖尿病作為心血管疾病獨立危險因素，可導致心肌結構與功能的改變，使得心肌對缺血再灌注的耐受性降低。既往研究表明，2型糖尿病在這一慢性病理狀態下可發生IR，通過抑制胰島素信號轉導和葡萄糖轉運，降低心肌對葡萄糖的利用，影響心肌代謝，進一步使ATP合成減少，損傷心肌組織[8-9]。

表1 各組大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR比較

注：FBG=空腹血糖，FINS=空腹胰島素，HOMA-IR=胰島素抵抗指數；與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病假手術組比較，△P<0.05；與心肌梗死組比較，▲P<0.05

表2 各組大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比較

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，MDA=丙二醛，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇；與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病假手術組比較，△P<0.05；與心肌梗死組比較，▲P<0.05

圖1 各組大鼠心臟病理學改變(HE，×400)

瘦素作為參與調控機體攝食、體溫、能量平衡的神經肽類物質，在脂類代謝、胰島素分泌等內分泌免疫機制中起重要調節作用，且與IR、糖及脂質代謝異常等密切相關[10]。研究證實，體內存在“脂肪-胰島素”內分泌軸[11]，通過這個內分泌軸，瘦素和胰島素對機體代謝發揮著雙向調節作用，瘦素的缺乏與過多均可導致IR。在MIRI過程中，瘦素水平會升高，高水平瘦素不僅可通過增強核因子κB (NF-κB)與活性蛋白的活性，導致炎癥反應加劇，還可促使內皮細胞內皮素1(ET-1)高表達而使血管痙攣，進一步加重心肌損傷[12]。

炎癥作為連接糖尿病和冠狀動脈粥樣硬化性疾病的紐帶，在相關疾病發病機制中發揮著媒介與預測作用[13-14]。炎性因子可通過減弱胰島素信號轉導中的酪氨酸磷酸化參與到IR發生機制之中。而TNF-α是體內炎癥反應的重要遞質，能誘導IR的產生，其可能通過抑制胰島素信號傳導與葡萄糖轉運因子4(GLUT-4)mRNA的表達，削弱相關受體的親和力[11，15]。同時，TNF-α還可通過促使中性粒細胞在缺血心肌組織的聚集、堵塞毛細血管，并釋放大量氧自由基和蛋白水解酶等物質，導致血管通透性的改變引發水腫進而加重心肌損傷[16-17]。

高糖與缺血再灌注時均可誘導細胞內大量氧自由基的生成，使機體處于氧化應激狀態，過多的氧自由基不僅可通過脂質過氧化反應損傷細胞膜，而且能誘導凋亡相關因子的釋放及心肌細胞線粒體膜通道的開放啟動瀑布式凋亡反應[18-19]，還可影響胰島素傳導系統中蛋白質磷酸化的過程，加重IR狀態[20]。隨著細胞內氧自由基增多，其代謝產物也增多。MDA作為細胞內最重要的脂質過氧化代謝產物，其水平能反映心肌細胞脂質過氧化程度與氧自由基活性[21]。

本實驗選取糖尿病MIRI大鼠模型，分別給予不同劑量外源性瘦素進行干預。與正常對照組相比，糖尿病5組大鼠的FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α與MDA水平均升高；與糖尿病假手術組相比，心肌梗死組大鼠3 h后，FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平升高；而與心肌梗死組相比，低劑量組與中劑量組3 h后，FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平下降；而高劑量組3 h后FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平不降反而升高。結果表明：在MIRI時，低、中劑量瘦素預處理可通過減少缺血心肌炎性因子與氧自由基產生，而降低TNF-α、MDA水平；并通過下調機體內實際瘦素水平，發揮由瘦素與胰島素介導的“脂肪-胰島素”內分泌軸激素雙向調節反饋作用，并可能因此改善由TNF-α、氧化應激及高瘦素水平所介導的IR狀態[22]，而發揮心肌保護作用。然而，高劑量瘦素預處理并未降低機體內實際瘦素水平，反而進一步升高機體瘦素水平，加劇炎性反應、氧化應激狀態及IR，加重糖尿病心肌在缺血再灌注的損傷程度。

2型糖尿病患者普遍存在不同程度的脂質代謝紊亂，脂質代謝紊亂是2型糖尿病患者并發急性冠狀動脈事件的危險因素之一[23]。高脂血癥也可影響胰島素受體磷酸激酶的活性和GLUT-4的轉位，導致IR，且TG水平與IR密切相關，其機制可能為：脂毒性所導致的胰島細胞功能障礙[24]。本實驗顯示，與正常對照組相比，糖尿病5組大鼠血脂TG、TC與LDL-C水平升高，HDL-C水平降低；心肌梗死組與糖尿病假手術組相比，血脂檢測各項指標水平無差異；與心肌梗死組相比，低劑量組與中劑量組3 h后，TG、TC與LDL-C水平降低，HDL-C水平升高。而高劑量組3 h后，TG、TC、LDL-C、HDL-C水平與心肌梗死組相比無變化。以上結果表明：一定濃度的瘦素預處理能夠改善血脂代謝紊亂，即通過“脂肪-胰島素”軸——脂肪增加可促使瘦素分泌，一定濃度的瘦素可抑制胰島素分泌，從而減少脂肪的合成與貯存；而高濃度的瘦素預處理并不會產生相應的調脂作用。

本研究表明，給予一定濃度外源性瘦素來干預糖尿病大鼠MIRI過程，可對受損心肌產生相應作用，且以低中劑量產生的保護作用效果最佳。其機制可能為：(1)低中劑量外源性瘦素預處理通過降低內源性瘦素實際水平而改善機體高瘦素水平狀態，并通過瘦素與胰島素之間雙向調控作用來改善IR狀態。(2)低中劑量瘦素預處理能夠下調TNF-α、MDA水平減輕心肌局部炎癥和脂質過氧化反應，并因此減少這些因素所介導的IR狀態而帶來的損傷。(3)低中劑量瘦素預處理能夠通過“脂肪-胰島素”軸改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂狀況。

綜上所述，在2型糖尿病大鼠MIRI發生發展的病理過程中，機體存在炎癥反應、氧化應激、高瘦素水平、IR及血脂紊亂等狀態，而低中劑量瘦素預處理可通過改善這些狀態而降低心肌損害作用，這為糖尿病患者MIRI的防治提供了新的方向。

1 Acar E,Ural D,Bildirici U,et al.Diabetic cardiomyopathy[J].Anadolu Kardiyol Derg,2011,11(8):732-737.

2 王光余，黃曉輝，吳國平.2型糖尿病大血管病變與血清CRP、IL-6、TNF-α水平的變化[J].海南醫學院學報，2009，15(9)：1012-1013.

3 覃泱，徐彤彤，武琦，等.瘦素與心血管疾病的相關性研究進展[J].中國全科醫學，2013，16(1)：226.

4 鞠靜，葛德帥，曹麗婭，等.非糖尿病充血性心力衰竭與胰島素抵抗的相關分析[J].實用心腦肺血管病雜志，2011，19(1)：67.

5 Zgibor JC,Ruppert K,Orchard TJ,et al.Development of a coronary heart disease risk prediction model for type 1 diabetes:the Pittshburgh CHD in Type 1 Diabetes Risk Model[J].Diabetes Res Clin Pract,2010,88(3):314-321.

6 韓婷，井源，陳梅，等.2型糖尿病患者踝肱指數與心血管危險因素的相關性研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2010，18(10)：1419.

7 楊一萍,駱媛,范禮斌,等.線粒體在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(4):577-580.

8 Schilling JD,Mann DL.Diabetic cardiomyopathy:bench to bedside[J].Heart Fail Clin,2012,8(4):619-631.

9 Reaven G.Insulin resistance and coronary heart disease in nondiabetic individuals[J].Arteriosclerosis Thrombosis and Vasc Biol,2012,32(8):1754-1759.

10 胡龍江,呂湛,茍連平.胰島素抵抗、瘦素抵抗與 2 型糖尿病并發冠心病的關系研究[J].中華臨床醫師雜志：電子版，2011,5(2):16.

11 Magge SN.Cardiovascular risk in children and adolescents with type 1 and type 2 diabetes mellitus[J].Current Cardiovascular Risk Rep,2012,6(6):591-600.

12 徐彤彤,劉世平.瘦素預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].廣東醫學,2010,31(7):810-812.

13 Bertoni AG,Burke GL,Owusu JA,et al.Inflammation and the incidence of type 2 diabetes:the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA)[J].Diabetes Care,2010,33(4):804-810.

14 潘佳秋,徐微微,張超.新診斷2型糖尿病患者血清高遷移率族蛋白1和Toll樣受體4水平變化及其與胰島素抵抗的關系研究[J].中國全科醫學,2013,16(1):252-254.

15 Yamato M,Shiba T,Ide T,et al.High-fat diet-induced obesity and insulin resistance were ameliorated via enhanced fecal bile acid excretion in tumor necrosis factor-alpha receptor knockout mice[J].Mol Cell Biochem,2012,359(1/2):161-167.

16 Büyükakilli B,Atici A,?zkan A,et al.The effect of tumor necrosis factor-α inhibitor soon after hypoxia-ischemia on heart in neonatal rats[J].Life Sci,2012,90(21/22):838-845.

17 朱海霞.慢性心力衰竭患者血清白介素6、高敏C反應蛋白和腫瘤壞死因子α水平的變化及臨床意義[J].中國全科醫學，2011，14(10)：3362.

18 Sun Y,Zhang Y,Yan M,et al.B-type natriuretic peptide-induced carioprotecion against reperfusion is associated with attenuation of mitochondrial permeability transition[J].Biol Pharm Bull,2009,32(9):1545-1551.

19 Lenaz G.Mitochondria and reactive oxygen species.Which role in physiology and pathology? [J] .Adv Exp Med Biol,2012,942:93-136.

20 Salim S,Asghar M,Chugh G,et al.Oxidative stress:a potential recipe for anxiety,hypertension and insulin resistance[J].Brain Res,2010,1359:178-185.

21 徐新蕾,蔡德亮.氧化應激指標與血管性癡呆的關系研究[J].中國全科醫學,2012,15(11):3887-3889.

22 Menghini R,Casagrande V,Menini S,et al.TIMP3 overexpression in macrophages protects from insulin resistance,adipose inflammation,and nonalcoholic fatty liver disease in mice[J].Diabetes,2012,61(2):454-462.

23 Orr P,Hobgood A,Coberley S,et al.Improvement of LDL-C laboratory values achieved by participation in a cardiac or diabetes disease management program[J].Dis Manag,2006,9(6):360-370.

24 呂肖峰,程千鵬.胰島素泵治療對初診2型糖尿病患者血糖、血脂、氧化應激的影響及胰島β細胞與超氧化物歧化酶的關系研究[J].中國全科醫學,2012,15(9):2902-2904.