“脾腎相關”機理探討補腎健脾方對脾腎兩虛型 骨質疏松癥大鼠外周血中OPG、RANKL、VIP、 MTL、GAS含量的影響?

李鴻泓，于 崢，趙宏艷，易小烈，潘靜華，劉 紅，李 艷，王少君， 陳 曦，湯爾群，張立石，李岳澤，張方珍，鞠大宏△，劉梅潔△

(1.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；2.石景山區中醫醫院， 北京 100041； 3.黔西縣中心醫院，江西 黔西 551500)

“脾腎相關”理論是中醫學的重要理論之一，是中醫認識疾病、診治疾病的重要思維方法，該理論在骨質疏松癥的防治過程中發揮著重要指導作用。既往課題組在建立骨質疏松癥脾腎兩虛型病證結合動物模型[1]的基礎上，探討了補腎健脾方對大鼠脾腎兩虛型骨質疏松癥的治療作用[2]。此次，本研究將對補腎健脾方的作用機理作進一步的深入探討，以期為闡明“脾腎相關”的科學內涵提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

選用健康雌性SPF級Wistar大鼠 86只，體質量200～220 g，由中國藥品生物制品檢定所提供(許可證編號SCXK(京)2009-0017)，在中日友好醫院臨床研究所動物室屏障系統飼養(實驗動物室許可證號：SYXK(京)2010-0011)。

1.2 藥物

己烯雌酚由合肥久聯制藥有限公司生產(批號20100120)，規格：每片1 mg，使用時用蒸餾水制成濃度為0.0046 mg/mL的混懸液，給藥體積為1 mL/100 g體質量，給藥劑量為0.046 mg/kg體質量。健脾方藥采用四君子湯：人參9 g，茯苓9 g，白術9 g，甘草6 g，常規水煎制，含量為3.04 g生藥/kg，給藥濃度為0.304 g/ml。補腎方藥采用龜鹿二仙湯：龜板膠9 g，鹿角膠6 g，人參9 g，枸杞9 g。常規水煎制含量為3.04 g生藥/kg，給藥濃度為0.304 g/ml。補腎健脾方藥采用龜鹿二仙湯合四君子湯：龜板膠9 g，鹿角膠6 g，人參9 g，枸杞9 g，茯苓9 g，白術9 g，甘草6 g。常規水煎制，含量為5.26 g生藥/kg，給藥濃度為0.526 g/ml。大黃水煎液：川大黃水煎制，濃縮至200%。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉由美國Sigma公司生產(批號20090305)，大鼠VIP ELISA試劑盒：美國MBS公司(批號W09083651)，大鼠GAS ELISA試劑盒：美國MBS公司(批號W09083650)，大鼠MTL ELISA試劑盒：美國MBS公司(批號W15083696)，大鼠RANKL ELISA試劑盒：美國R&B公司(批號07081103)，大鼠OPG ELISA試劑盒：美國R&B公司(批號07081102)。

1.4 儀器

Wellwash 4 Mk2洗板機：美國Thermo公司，Multiskan Mk3酶標儀：美國Thermo公司， TDZ5-WS多管架自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司，Osteocore3 Digital 2D 骨密度儀(雙能X線)：法國Medilink公司，-80℃低溫冰箱：美國 Thermo公司。

1.5 方法

1.5.1 動物分組、模型制作及處理 選用健康雌性Wistar大鼠86只，按隨機數字表法分為空白對照組12只、假手術組12只、造模62只3組。所有大鼠適應性喂養1周后，造模組大鼠制作脾腎兩虛型骨質疏松癥模型[1]。假手術組大鼠只切除小塊脂肪組織，不摘除卵巢。造模完成后，將造模組大鼠隨機分成脾腎兩虛模型組、己烯雌酚組、補腎組、健脾組及補腎健脾組。除脾腎兩虛模型組大鼠外，其余大鼠分別給予己烯雌酚、龜鹿二仙湯、四君子湯及兩者的合方，每日1次，連續6 d，休息1 d，再連續給藥6 d，每周稱重1次，據此調整給藥量。同時，脾腎兩虛模型組大鼠給予200%的大黃水煎液灌胃，每周2次，如此給藥3個月。空白對照組、假手術組按同法灌服等體積蒸餾水。給藥結束后，采用大鼠麻醉后股動脈取血法，所取全血靜置1 h后，經2000 rmp離心10 min后取血清；取血后將各組大鼠處死取出左側股骨，剔除骨骼表面附著的軟組織，用生理鹽水浸濕的紗布包裹，放于-80℃冰箱保存待測，用于骨密度(BMD)檢測。

1.5.2 指標檢測 BMD檢測：檢測前取出冰箱中凍存的大鼠股骨室溫下復溫。采用Osteocore3 Digital 2D 骨密度儀檢測各組大鼠股骨的骨密度。

血管活性腸肽(VIP)、胃動素(MTL)、胃泌素(GAS)、骨保護素(OPG)、細胞核因子κB受體活化因子配基(RANKL)含量的測定：檢測前取出凍存的大鼠血清在室溫下復溫。采用ELISA法，按照試劑盒所附說明書檢測大鼠外周血血清中VIP、MTL、GAS、OPG、RANKL的含量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 補腎健脾方對脾腎兩虛型骨質疏松大鼠股骨BMD的影響

表1顯示，與假手術組比較，脾腎兩虛模型組大鼠股骨BMD顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，補腎組、健脾組、補腎健脾組、己烯雌酚組大鼠股骨BMD均顯著增高，但仍顯著低于假手術組。與健脾組比較，補腎組及補腎健脾組的BMD均明顯增高，且兩者之間比較差異無統計學意義。

2.2 補腎健脾方對脾腎兩虛型骨質疏松大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量的影響

表2顯示，脾腎兩虛模型組OPG含量較之假手術組顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組OPG含量差異無統計學意義；而己烯雌酚組、補腎組、補腎健脾組OPG含量均顯著增高，但仍顯著低于假手術組。與健脾組比較，補腎組和補腎健脾組OPG含量均明顯增高，且補腎健脾組明顯高于補腎組。

表1 各組大鼠股骨BMD的變化

注：與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與脾腎兩虛模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01；與健脾組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與補腎組比較：P<0.05，P<0.01(下同)

與假手術組比較，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中RANKL含量顯著增高。與脾腎兩虛模型組比較，己烯雌酚組、健脾組、補腎組、補腎健脾組RANKL含量均顯著降低，但較之假手術組仍顯著增高。與健脾組比較，補腎組和補腎健脾組RANKL含量均顯著降低，且補腎健脾組明顯低于補腎組。

表2 各組大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量

2.3 補腎健脾方對脾腎兩虛型骨質疏松大鼠外周血血清中VIP含量的影響

表3顯示，與假手術組比較，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中VIP含量顯著增高。從各治療組VIP含量來看，除己烯雌酚組外，健脾組、補腎組、補腎健脾組VIP含量均顯著低于脾腎兩虛模型組，但健脾組和補腎組仍明顯高于假手術組，而補腎健脾組與假手術組比較差異無統計學意義。與補腎組比較，健脾組和補腎健脾組VIP含量明顯降低，且兩者之間比較差異無統計學意義。

表3 各組大鼠外周血血清中VIP含量

2.4 補腎健脾方對脾腎兩虛型骨質疏松大鼠外周血血清中MTL、GAS含量的影響

表4顯示，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中MTL、GAS含量較之假手術組顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組和補腎健脾組MTL、GAS含量均顯著增高，但己烯雌酚組和補腎組比較差異無統計學意義。健脾組和補腎健脾組MTL含量均顯著高于補腎組，補腎健脾組GAS含量明顯高于健脾組和補腎組。

表4 各組大鼠外周血血清中MTL及GAS含量

3 討論

1988年鄧鐵濤在“略論五臟相關取代五行學說”的文章中明確提出“五臟相關學說”的概念[3]，而脾腎相關理論正是其提出的“五臟相關學說”的一個重要子系統。具體到骨質疏松癥(OP)這一常見病、多發病來說，脾腎相關理論在其防治過程中也發揮著重要指導作用。《素問·五臟生成》曰：“腎之合骨也，其榮發也，其主脾也。”骨的生長、發育不僅直接取決于腎，還受到后天脾胃功能的影響。近年來，一些醫家在補腎健脾這一治則的指導下，采用補腎健脾方藥治療骨質疏松癥，普遍取得了較好的療效[4]。如王照康[5]自擬補腎健脾密骨方，對老年骨質疏松患者疼痛及相關生化指標具有明顯的改善作用。王惠禮[6]等觀察了具有調補脾腎作用的院內自制劑骨康寧膠囊對原發性骨質疏松癥的療效，結果發現，在治療后患者癥狀改善明顯，骨密度隨之增加。本課題組以往的研究也證實[2]，補腎健脾方能明顯提高脾腎兩虛型骨質疏松大鼠的TBV%。本研究結果亦表明，經補腎健脾方治療后，脾腎兩虛型骨質疏松大鼠的BMD明顯增高，說明補腎健脾方對其有明顯的治療作用。而補腎健脾方治療骨質疏松癥的機理何在？這是本研究深入探討的關鍵問題。

OPG/RANKL在破骨細胞生成、分化、發育、成熟、激活過程中起決定性作用，是非常重要的破骨細胞分化調節信號因子。Yasuda[7]在研究發現，OPG基因敲除小鼠皮質骨和骨小梁減少，易出現嚴重的骨質疏松癥。 Shimizu-Ishiura等[8]則研究了OVX小鼠，發現給予OPG的OVX小鼠骨小梁增加明顯，而未給予OPG的OVX小鼠骨小梁減少，說明OPG可以抑制骨吸收而減少骨量丟失。RANKL是能夠直接刺激破骨細胞發育和使之激活的惟一細胞因子，它與破骨細胞表面的RANK相結合，強有力地促進破骨細胞的生成、分化和成熟，并能增強破骨細胞運動能力；同時還可以抑制破骨細胞的凋亡，延長其存活時間[9，10]。

VIP及GAS、MTL均是衡量脾虛證的重要指標[11-12]。如黃學寬等[13]觀察了具有益氣健脾、行氣消食作用的六味和中散對脾虛模型大鼠胃腸激素的影響。研究發現，脾虛模型大鼠VIP水平顯著增高，GAS、MTL水平比正常對照組顯著降低；經六味和中散治療后上述指標發生逆轉。近年來有研究表明，VIP與骨吸收密切相關[14，15]。如Perssona[16]研究發現，VIP能以時間、濃度依賴的方式刺激小鼠顱骨成骨細胞IL-6(白細胞介素6)mRNA的表達和蛋白的釋放，而IL-6是一種強有力的骨吸收刺激因子，因此VIP能促進骨吸收。

本研究結果顯示，與脾腎兩虛模型組比較，補腎組、補腎健脾組OPG含量均顯著增高，而健脾組與之比較差異無統計學意義；與健脾組比較，補腎組和補腎健脾組OPG含量均明顯增高，且補腎健脾組明顯高于補腎組。健脾組、補腎組、補腎健脾組RANKL、VIP含量均顯著低于脾腎兩虛模型組；與健脾組比較，補腎組RANKL含量降低更明顯，且補腎健脾組又明顯低于補腎組；與補腎組比較，健脾組和補腎健脾組VIP含量降低更為明顯。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組和補腎健脾組MTL和GAS含量均顯著增高，而補腎組與之比較差異無統計學意義，且補腎健脾組GAS含量明顯高于健脾組和補腎組。

以上結果說明，健脾方、補腎方和補腎健脾方均能提高脾腎兩虛型骨質疏松大鼠的BMD，其中補腎健脾方的效果最佳。補腎健脾方可通過上調OPG、MTL、GAS水平，并下調RANKL、VIP水平，從而達到對脾腎兩虛型骨質疏松癥的治療作用。健脾方對MTL、GAS、VIP的調節作用強于補腎方，補腎方對OPG、RANKL的調節作用強于健脾方，而補腎健脾方對上述指標的調節作用均明顯強于以上兩方。這是補腎健脾方療效優于補腎方和健脾方的機制之一，也進一步說明在骨質疏松癥的發生和治療過程中，中醫的脾腎兩臟是密切相關的。但必須指出的是，骨質疏松癥作為一種病機涉及多臟器、病理包括多環節的復雜性疾病，補腎健脾法治療骨質疏松癥的作用機理必然是多方面的。本研究只是從一個角度進行了探討，其他機理還有待進一步的深入研究。

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[2] 鞠大宏，李鴻泓，劉紅，等. 補腎健脾方對大鼠脾腎兩虛型骨質疏松癥的治療作用[J].中華中醫藥雜志，2012,27(12)：3207-3210.

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