Toll樣受體4及骨形成蛋白2表達(dá)在慢性阻塞性肺疾病患者血管重塑中的作用研究

張馨文，叢金鵬，董 蕾，于文成

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展為特征，可以預(yù)防和治療的疾病[1-2]，常表現(xiàn)為氣道、肺實(shí)質(zhì)及血管的慢性炎癥。其中肺血管的慢性炎癥及其所引起的肺血管重塑被認(rèn)為是COPD的基本病理特征之一，但其機(jī)制尚待闡明。近年有關(guān)Toll樣受體4(TLR-4)及骨形成蛋白2(BMP-2)在肺血管重塑中可能具有重要作用的報(bào)道多數(shù)來自動物模型[3-5]，但二者在COPD患者體內(nèi)表達(dá)情況及其作用的研究尚未見報(bào)道。本研究以COPD肺組織標(biāo)本為材料，對其中TLR-4、BMP-2及平滑肌細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并將其表達(dá)水平與肺血管重塑進(jìn)行了相關(guān)性分析，為COPD的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與處理 肺組織標(biāo)本取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科2012年7月—2013年7月住院需要手術(shù)治療的50例男性高分化肺鱗癌患者。根據(jù)是否患有COPD將患者分為COPD組和對照組，各25例。COPD診斷依據(jù)慢性阻塞性肺疾病診治標(biāo)準(zhǔn)[1]，且COPD患者均處于穩(wěn)定期，無其他肺部及其他系統(tǒng)性疾病。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)前肺功能測定，COPD組第1秒用力呼氣末容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)、第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組患者年齡和肺功能比較

注：FEV1%=第1秒用力呼氣末容積占預(yù)計(jì)值百分比；FEV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比

1.2 標(biāo)本處理 手術(shù)切除患者肺葉后，取遠(yuǎn)離腫瘤部位5 cm以上未見浸潤的正常外周肺組織，石蠟包埋切片。所有標(biāo)本的使用符合知情同意原則。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，選擇直徑為100～500 μm的動脈，半定量評價動脈壁及周圍炎性細(xì)胞浸潤程度。炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)：無炎性細(xì)胞浸潤為0分；少許炎性細(xì)胞浸潤為1分；浸潤的炎性細(xì)胞較多但分布不均勻?yàn)?分；炎性細(xì)胞浸潤較多，分布均勻，但不聚集成團(tuán)為3分；大量炎性細(xì)胞浸潤并聚集成團(tuán)為4分。隨機(jī)選取橫斷面較圓且結(jié)構(gòu)完整的5條肺小動脈，Dotslide取像并測量肺小動脈管壁內(nèi)外徑及管壁厚度與管壁面積，計(jì)算管壁厚度占外徑百分比(WT%)和血管壁橫斷面積占血管總面積百分比(WA%)，取其平均值記為各組的血管重塑指標(biāo)。

1.4 免疫組化染色法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA 采用PV-6000二步法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA，嚴(yán)格按照試劑盒(購自美國3M公司)說明書進(jìn)行操作。每張切片在400倍視野下隨機(jī)采集5條直徑100～500 μm肺小動脈，請兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理專業(yè)醫(yī)師觀察同一血管壁橫斷面，計(jì)數(shù)并取其均值。TLR-4、BMP-2以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒改變?yōu)殛栃员磉_(dá)，觀察計(jì)數(shù)肺動脈平滑肌細(xì)胞中TLR-4、BMP-2陽性細(xì)胞數(shù)占總平滑肌細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)為TLR-4、BMP-2表達(dá)水平；PCNA陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒則為增殖細(xì)胞，觀察計(jì)數(shù)PCNA陽性細(xì)胞占總平滑肌細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)為PCNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺血管炎性細(xì)胞浸潤及重塑程度比較 光學(xué)顯微鏡下COPD組肺血管管壁及周圍有大量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，肺血管管壁明顯增厚，管腔狹窄，細(xì)胞間質(zhì)增多，出現(xiàn)肺血管重塑現(xiàn)象。COPD組患者炎癥評分、WT%、WA%均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table2 Comparison of inflammatory infiltration degree and vascular remodeling degree between the two groups

組別例數(shù)炎癥評分(分)WT%WA%對照組250 4±0 614 2±1 721 6±1 8COPD組251 6±0 827 8±3 435 7±3 0t值-6 278-17 624-19 942P值<0 01<0 01<0 01

注：WT%=管壁厚度占外徑百分比，WA%=血管壁橫斷面積占血管總面積百分比

2.2 兩組TLR-4、BMP-2及PCNA陽性表達(dá)水平比較 COPD組患者肺動脈血管平滑肌細(xì)胞TLR-4、BMP-2、PCNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達(dá)水平與血管重塑相關(guān)性 COPD組患者肺動脈平滑肌細(xì)胞TLR-4、BMP-2水平與炎癥評分、WT%、WA%及PCNA水平均呈正相關(guān)，PCNA水平與WT%、WA%、炎癥評分均呈正相關(guān)(P<0.05,見表4)。

Table3 Comparison of the levels of expression of TLR-4，BMP-2 and PCNA between the two groups

組別例數(shù)TLR-4BMP-2PCNA對照組25 9 5±9 4 5 0±4 6 7 8±5 0 COPD組2529 3±16 030 9±21 328 3±12 7t值-5 344-6 099-7 522P值<0 01<0 01<0 01

注：TLR-4=Toll樣受體4，BMP-2=骨形成蛋白2，PCNA=增殖細(xì)胞核抗原

表4 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達(dá)水平與WT%、WA%、PCNA及炎癥評分的相關(guān)性(r值)

Table4 Correlation between the expression level of TLR-4,BMP-2，PCNA and WT%,WA%,PCNA，inflammation score in COPD group

TLR-4BMP-2PCNAWT%0 476?0 642?0 709?WA%0 622?0 550?0 713?PCNA0 322?0 558?-炎癥評分0 445?0 520?0 385?

注：*P<0.05；-為無此項(xiàng)

3 討論

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類天然免疫受體，可激活天然免疫、誘導(dǎo)獲得性免疫，其在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注[6]。TLR-4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白，其主要識別革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[7]。LPS進(jìn)入肺臟后與TLR-4結(jié)合，產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子的合成和釋放，引起肺部炎性反應(yīng)[8]。孟瑩等[3]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在煙熏和脂多糖聯(lián)合煙熏所致肺部炎癥損傷大鼠中TLR-4的表達(dá)量較對照組明顯增加，指出TLR-4可能參與了大鼠肺部炎性反應(yīng)及COPD的形成。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的一員[9]，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、分化、組織修復(fù)、炎性反應(yīng)、血管形成等作用[10]。BMP-2是這一家族的主要成員，其與受體結(jié)合后能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[11]。楊瑩等[5]實(shí)驗(yàn)表明，慢性低氧可引起大鼠肺小動脈壁BMP-2表達(dá)的上調(diào)，證實(shí)BMP-2可能在低氧性肺血管重塑過程中發(fā)揮一定作用。

本研究表明，COPD組血管炎癥程度、血管重塑指標(biāo)(WT%、WA%)明顯高于對照組，提示COPD血管存在炎性反應(yīng)，后者可能直接或間接誘導(dǎo)血管重塑的發(fā)生；而肺動脈平滑肌細(xì)胞TLR-4的表達(dá)與對照組相比明顯提高，且其表達(dá)水平與血管炎癥程度、血管重塑指標(biāo)呈正相關(guān)，表明TLR-4參與了血管炎癥的發(fā)生，炎癥進(jìn)一步引起了血管重塑，且與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)。這一研究結(jié)果提示，TLR-4可能通過誘導(dǎo)肺動脈平滑肌的增殖，平滑肌的增生引起血管壁的增厚，管腔狹窄，引起肺血管重塑，繼而導(dǎo)致肺動脈高壓的產(chǎn)生。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，家族性肺動脈高壓及部分特發(fā)性肺動脈高壓的患者存在BMPR-Ⅱ的基因突變，由于BMP與BMPR-Ⅱ、BMPR-Ⅰ復(fù)合物形成缺陷，致使肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)增加，而凋亡作用減弱[12-13]。目前尚未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMPR-Ⅱ基因突變與COPD引起的低氧性肺動脈高壓有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，COPD組肺動脈平滑肌細(xì)胞BMP-2表達(dá)較對照組明顯升高，且與反映肺小動脈平滑肌細(xì)胞增殖的PCNA、與反映肺血管重塑程度的指標(biāo)WT%、WA%及炎癥程度呈正相關(guān)。其機(jī)制可能在于，COPD患者長期的慢性低氧可引起血管BMP-2的上調(diào)，致使肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，繼而造成肺血管重塑的形成，從而引起低氧性肺動脈高壓，這與家族性肺動脈高壓及部分特發(fā)性肺動脈高壓產(chǎn)生的機(jī)制不同。

總之，COPD患者肺血管平滑肌中TLR-4及BMP-2的表達(dá)水平增加，均能夠從促進(jìn)炎性反應(yīng)及血管平滑肌細(xì)胞的增殖兩個途徑引起COPD患者血管重塑，進(jìn)而促進(jìn)肺動脈高壓的形成。因此，及時檢測TLR-4及BMP-2的表達(dá)水平，可能有助于COPD的早期診斷及其病情嚴(yán)重程度的觀察，這對防治COPD的進(jìn)展、改善其預(yù)后等具有一定臨床意義。但本研究在應(yīng)用到臨床患者的治療中如發(fā)展靶向治療的方法，具有一定的局限性，故今后還有待進(jìn)一步研究。

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