支氣管哮喘不同表型血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平的關(guān)系研究

鄒 暉，方秋紅，馬迎民，王學(xué)艷

支氣管哮喘是一種異質(zhì)性、慢性氣道炎癥性疾病，包含不同表型，其特點為可逆性的氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性(AHR)[1]。支氣管哮喘的表型可以根據(jù)臨床表現(xiàn)進行分類，也可以根據(jù)炎癥類型的免疫病理，特殊炎癥細胞種類分為嗜酸粒細胞型或中性粒細胞型[1-3]。不同表型的支氣管哮喘患者有其自然病程，治療反應(yīng)以及預(yù)后均不一樣，因此區(qū)分不同的支氣管哮喘表型具有重要的臨床意義[1-2]。

生長因子在支氣管哮喘的氣道炎癥和氣道重構(gòu)中起著重要作用。有研究報道，表皮生長因子(EGF)與其受體在支氣管哮喘支氣管上皮[4-6]、氣道上皮、腺體、平滑肌中廣泛表達，而且EGF參與支氣管哮喘氣道重構(gòu)的病理生理過程[6]。EGF可以直接作用于氣道平滑肌，促進平滑肌增殖，參與支氣管哮喘的氣道重構(gòu)[7-8]。活化的EGF受體和血小板衍生生長因子(PDGF)受體激酶使氣道平滑肌細胞、上皮細胞和杯狀細胞增生[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)水平明顯高于非支氣管哮喘者，而且在過敏原暴露后其水平進一步增高，提示bFGF與支氣管哮喘的氣道重構(gòu)有關(guān)[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期以及急性加重期支氣管哮喘患者血清及誘導(dǎo)痰中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平增高，且VEGF及其受體的表達與新生血管形成關(guān)系密切，預(yù)示著氣道重構(gòu)的發(fā)生[11]。

臨床需要實用、可操作、可重復(fù)的有意義的指標評估支氣管哮喘患者的氣道炎癥、病情的嚴重程度，從而指導(dǎo)臨床選擇針對性治療和對其預(yù)后的評判。鑒于EGF、bFGF、PDGF以及VEGF在支氣管哮喘發(fā)病機制氣道炎癥、AHR和氣道重構(gòu)中的重要作用，且目前血清及誘導(dǎo)痰中EGF、bFGF、PDGF以及VEGF水平與支氣管哮喘不同臨床表型間的關(guān)系系統(tǒng)報道較少。因此，本研究旨在探討支氣管哮喘患者血清及誘導(dǎo)痰中EGF、bFGF、PDGF以及VEGF水平之間的關(guān)系，以期指導(dǎo)臨床工作。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年6月—2011年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診及住院的支氣管哮喘急性發(fā)作患者62例，其均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組2008年制定的支氣管哮喘防治指南中的診斷標準[12]，近期出現(xiàn)不同頻度和/或不同程度的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。排除慢性阻塞性肺疾病(COPD)、活動性急或慢性肺部其他疾病以及其他嚴重免疫性疾病、惡性腫瘤、冠心病、高血壓、妊娠及哺乳期婦女。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會同意且所有受試者知情同意。

1.2 不同支氣管哮喘臨床表型分組方法以及標準 根據(jù)患者誘導(dǎo)痰細胞不同分為嗜酸粒細胞表型組和中性粒細胞表型組；根據(jù)患者肺功能分為第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)≥70%組和FEV1/FVC<70%組，采用德國JEGER公司生產(chǎn)的肺功能儀檢測患者FEV1/FVC水平；患者病情嚴重程度分級標準參考文獻[12]，分為輕度組、中度組和重度組。

1.3 治療方法 患者均給予規(guī)范化治療，包括按需使用短效β2受體激動劑，吸入糖皮質(zhì)激素及長效β2受體激動劑的聯(lián)合治療以及白三烯受體拮抗劑治療。

1.4 誘導(dǎo)痰技術(shù) 參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會推薦的步驟進行。操作方法：(1)誘導(dǎo)前10 min患者吸入沙丁胺醇400 μg；(2)霧化吸入前清水漱口、擤鼻；(3)3%高滲鹽水超聲霧化吸入15 min，用力咳痰至培養(yǎng)皿；(4)若患者無痰或痰量不足則換用4%高滲鹽水繼續(xù)霧化7 min；(5)若患者繼續(xù)無痰或痰量不足則換用5%高滲鹽水繼續(xù)霧化，7 min后終止誘導(dǎo)程序；(6)痰液稱重，加入4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)充分混合，37 ℃水浴10 min，離心沉淀細胞，計數(shù)細胞總數(shù)。沉淀涂片，蘇木素-伊紅(HE)染色，細胞分類計數(shù)，計算嗜酸粒細胞及中性粒細胞分數(shù)[13]。

1.5 生長因子測定 痰液進行處理后留取上清液，于-80 ℃冰箱中保存待用。于清晨采集靜脈血2 ml，以1 780×g在離心機中離心10 min，留取血清，于-80 ℃冰箱中保存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測上清液及血清中EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB以及VEGF水平。試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，嚴格按照說明書操作步驟進行。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 根據(jù)分組標準，中性粒細胞表型組48例，嗜酸粒細胞表型組14例；FEV1/FVC≥70%組24例，F(xiàn)EV1/FVC<70%組38例；輕度組38例，中度組10例，重度組14例。中性粒細胞表型組和嗜酸粒細胞表型組年齡、性別、病程、發(fā)病年齡<40歲、吸煙率、過敏性鼻炎發(fā)生率、支氣管哮喘家族史、總免疫球蛋白E(T-IgE)、第1秒用力呼氣末容積(FEV1)、FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；輕度組、中度組和重度組上述幾項指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；FEV1/FVC≥70%組和FEV1/FVC<70%組年齡、性別、病程、發(fā)病年齡<40歲、吸煙率、過敏性鼻炎發(fā)生率、支氣管哮喘家族史、血清嗜酸粒細胞分數(shù)、T-IgE比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組FEV1、FEV1/FVC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 不同表型分類支氣管哮喘患者一般資料比較

注：*為χ2值；T-IgE=總免疫球蛋白E，F(xiàn)EV1=第1秒用力呼氣末容積，F(xiàn)EV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比

2.2 血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平 血清EGF、PDGF-AA、VEGF水平均低于誘導(dǎo)痰中水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清bFGF、PDGF-BB水平均高于誘導(dǎo)痰中水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 支氣管哮喘急性發(fā)作患者血清及誘導(dǎo)痰生長因子水平比較

注：EGF=表皮生長因子，bFGF=堿性成纖維細胞生長因子，PDGF-AA=血小板衍生生長因子AA，PDGF-BB=血小板衍生生長因子BB，VEGF=血管內(nèi)皮生長因子

2.3 不同支氣管哮喘臨床表型血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平 血清及誘導(dǎo)痰中EGF、bFGF、PDGF-AA及PDGF-BB在不同支氣管哮喘臨床表型各組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。血清及誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細胞表型組VEGF水平高于中性粒細胞表型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清及誘導(dǎo)痰中FEV1/FVC<70%組VEGF水平高于FEV1/FVC≥70%組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清及誘導(dǎo)痰中重度支氣管哮喘組VEGF水平分別高于輕度組和中度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、4)。

表3 不同表型支氣管哮喘患者血清中生長因子水平比較

注：與重度組比較，*P<0.05

2.4 治療前后血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平 在治療1個月后，只隨訪到9例患者的完整資料，對9例患者的血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平進行檢測，結(jié)果顯示，治療前后血清及誘導(dǎo)痰中EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB和VEGF水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表5、6)。

表4 不同表型支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰中生長因子水平比較

注：與重度組比較，*P<0.05

Table5 Comparison of serum growth factors levels in 9 cases before and after treatment

EGF(ng/L)bFGF(ng/L)PDGF-AA(μg/L)PDGF-BB(ng/L)VEGF(ng/L)治療前1 23±1 19106 12±54 180 33±0 3011486 84±7946 0912 35±11 79治療后0 98±0 37102 87±34 620 11±0 1013896 12±5887 627 85±6 89t值0 1620 0233 1850 5340 525P值0 6920 8810 0930 4750 479

Table6 Comparison of sputum growth factors levels in 9 cases before and after treatment

EGF(ng/L)bFGF(ng/L)PDGF-AA(μg/L)PDGF-BB(ng/L)VEGF(ng/L)治療前19 68±19 041 13±0 5843 56±36 2038 29±26 4974 10±64 74治療后15 68±11 921 09±0 3714 52±12 1646 32±19 6347 10±39 34t值0 4130 1511 0740 3250 130P值0 3900 5700 2130 3170 738

3 討論

生長因子在支氣管哮喘的氣道炎癥和氣道重構(gòu)中起重要作用。本研究探討了血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平與支氣管哮喘臨床表型之間的關(guān)系。結(jié)果提示，EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-BB及VEGF在血清及誘導(dǎo)痰中均能檢測到，且血清及誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細胞表型組VEGF水平高于中性粒細胞表型組，F(xiàn)EV1/FVC<70%組高于FEV1/FVC≥70%組，重度組分別高于輕度組和中度組。提示VEGF可能與嗜酸粒細胞型支氣管哮喘，氣道氣流受限以及支氣管哮喘的嚴重程度有關(guān)。而EGF、bFGF、PDGF-AA及PDGF-BB在各表型分組中無明顯差別。

EGF、bFGF、PDGF以及VEGF在人體組織細胞分布廣泛。這些生長因子合成后釋放到體液或血液中，其在痰液或血清中的表達水平取決于多種因素。本研究結(jié)果顯示，血清EGF、PDGF-AA、VEGF水平均低于誘導(dǎo)痰中水平，血清bFGF、PDGF-BB水平均高于誘導(dǎo)痰中水平。在誘導(dǎo)痰的收集和處理環(huán)節(jié)多會影響檢測水平，血清中則相對穩(wěn)定。另外，機體在生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)時生長因子的表達會明顯不同，同樣也會影響不同部位生長因子水平的變化。

EGF、bFGF、PDGF-AA及PDGF-BB與哮喘發(fā)病機制的關(guān)系也非常密切。但在本研究中其在各表型中的水平無明顯差別，可能與選取的研究對象和樣本例數(shù)不多有關(guān)。

VEGF的主要來源為外周血嗜酸粒細胞[14-15]、BALF中嗜酸粒細胞[16]以及氣道中其他細胞如上皮細胞、肥大細胞、肌成纖維細胞和平滑肌細胞[17]。多項研究發(fā)現(xiàn)，兒童支氣管哮喘患兒血清及誘導(dǎo)痰中VEGF水平明顯增高[18-19]。本研究結(jié)果顯示，嗜酸粒細胞表型組嗜酸粒細胞分數(shù)明顯高于中性粒細胞表型組，提示血清及誘導(dǎo)痰中增高的VEGF水平可能與外周血以及誘導(dǎo)痰中增高的嗜酸粒細胞及嗜酸粒細胞氣道炎癥明顯相關(guān)。

美國國家心肺血液研究所工作組指出，支氣管哮喘研究的重點應(yīng)該是血管的研究。因為氣道血管的重構(gòu)和組織水腫是支氣管哮喘氣道炎癥機制和生理異常的重要表現(xiàn)。VEGF在氣道炎癥、血管生成和血管通透性增加、上皮下膠原沉積、氣道平滑肌增生以及氣道生理異常中起重要作用[20-21]。VEGF可以使黏膜和黏膜下血管床通透性增高，從而導(dǎo)致氣道壁增厚。因此，黏膜的水腫對氣道功能會產(chǎn)生嚴重影響[18，22]。有研究還發(fā)現(xiàn)，重度支氣管哮喘患者較輕度和中度支氣管哮喘患者有更多的血管生成[23-24]。本研究結(jié)果顯示，重度組血清及誘導(dǎo)痰中VEGF水平分別高于輕度組和中度組，F(xiàn)EV1/FVC<70%組VEGF水平高于FEV1/FVC≥70%組，提示VEGF可能通過氣道炎癥，新生血管生成，血管通透性增加導(dǎo)致氣道黏膜水腫，氣道壁增厚，使患者氣道功能發(fā)生不可逆的氣流受限，加重支氣管哮喘嚴重程度。

多項研究提示，予以吸入激素治療可以降低生長因子表達水平。Kanazawa等[25]報道，支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰中VEGF水平經(jīng)過1年的吸入激素治療后明顯降低。Asai等[17]報道，支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰中VEGF水平經(jīng)過8周的吸入激素治療后，其水平明顯下降。Abdel-Rahman等[19]報道，兒童支氣管哮喘患兒急性發(fā)作時，誘導(dǎo)痰中VEGF水平經(jīng)6周的吸入激素治療后，其水平明顯下降。本研究有9例患者經(jīng)吸入激素治療1個月后，再次檢測其血清及誘導(dǎo)痰中生長因子水平發(fā)現(xiàn)，EGF、bFGF、PDGF-AA以及VEGF水平治療后較治療前有所下降，但無差異，究其原因可能是樣本量少，沒有區(qū)分不同表型的支氣管哮喘患者，觀察治療時間沒有足夠長等因素。

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