瘦素-下丘腦神經肽Y軸在2型糖尿病大鼠發病過程中的變化

楊新玲，李 杰，盧素玉，王海芳，郝慧瑤，張松筠

瘦素是一種脂肪細胞分泌的能量平衡調節激素，可抑制食欲、增加能量消耗、減輕體質量[1]。下丘腦神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一種很強的食欲刺激因子，主要來自下丘腦弓狀核，在攝食行為和能量消耗的整合中起重要作用[2]。NPY神經元是瘦素在中樞的作用位點，瘦素可與NPY神經元上瘦素受體結合，抑制NPY合成與分泌[3]，二者形成瘦素-下丘腦NPY軸，調節機體能量代謝。

大量研究表明瘦素與肥胖、2型糖尿病密切相關[4-6]。筆者先前的研究也已經證實，在2型糖尿病(正常→胰島素抵抗→2型糖尿病)發病過程中大鼠血清瘦素水平呈遞增趨勢[7]。但NPY與2型糖尿病關系的研究還很少，且主要局限于肥胖及2型糖尿病患者[8-9]，2型糖尿病發生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關系國內外均未見報道。本研究通過觀察在2型糖尿病大鼠模型形成過程中，瘦素、下丘腦NPY水平的變化，探討瘦素-下丘腦NPY軸在2型糖尿病大鼠發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選用清潔級180～220 g雄性SD大鼠110只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 本研究通過改良的高脂飲食加小劑量(15 mg/kg)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)法建立2型糖尿病大鼠模型[10]。采用隨機數字表法抽取20只作為正常對照組，喂以基礎飼料；90只喂以高脂飼料(在基礎飼料的基礎上加10%豬油和2%膽固醇)，4周時將體質量超過正常對照組最高體質量的大鼠(60只)納入高脂飲食誘導肥胖(diet-induced obese，DIO)組，余者淘汰，該時間點設為DIO4W，采用隨機數字表法選取20只為DIO4W組；其余40只繼續喂以高脂飼料4周(此時間點設為DIO8W)，采用隨機數字表法選取20只為DIO8W組；剩余大鼠腹腔注射小劑量STZ，10 d后測空腹血糖大于正常對照組大鼠均值加3個標準差 (本研究確定該值為7.8 mmol/L)，且空腹血糖>7.8 mmol/L能維持3周者納入2型糖尿病組(20只)。

1.3 空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平測定 采用放射免疫法檢測空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平，實驗大鼠禁食8 h，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，心臟穿刺采血2 ml，4 ℃離心，取血清，檢測瘦素水平；經心臟以0.9%氯化鈉溶液灌洗全腦，斷頭取腦，以0.2 mol/L醋酸溶液煮沸10 min以滅活酶，取下丘腦，加入上述醋酸溶液1 ml勻漿，離心，取上清液，檢測NPY水平。操作過程嚴格按照試劑盒(北京原子高科核技術應用股份有限公司)說明書進行，質控標準為批內變異系數<10%，批間變異系數<15%。

1.4 下丘腦NPY mRNA表達水平測定 采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測下丘腦NPY mRNA的表達。取下丘腦組織100 mg，迅速將組織置于4 ℃焦碳酸二乙酯(DEPC)水中洗去血液后，置凍存管保存于-80 ℃低溫冰箱中。用Trizol(美國 Invitrogen 公司)提取海馬組織總RNA后，用1.5%含EB的瓊脂糖凝膠鑒定RNA質量，用核酸蛋白測定其水平及純度。引物(美國 Invitrogen 公司)序列為：上游： 5′-GCTAGGTAACAAACGAATGGGG-3′； 下游： 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGC-3′。PCR擴增條件：94 ℃預熱5 min，94 ℃ 45 s、55.5 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s(共35個循環)，72 ℃延伸5 min。取10 μl PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker作為標準片段標記，以GAPDH電泳條帶作為參照，結果用RT-PCR擴增靶基因產物的表達水平與GAPDH表達水平積分吸光度的比值表示。

2 結果

2.1 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平均高于DIO4W組，差異有統計學意義(P<0.05)；2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平高于DIO8W組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of fasting serum leptin and hypothalamic NPY levels in the four groups

組別例數血清瘦素水平(μg/L)下丘腦NPY水平(ng/L)正常對照組200 25±0 04133 5±16 9DIO4W組200 32±0 04?164 9±20 6?DIO8W組200 40±0 03?○199 4±36 9?○2型糖尿病組200 48±0 06?○△255 1±40 8?○△F值87 025270 782P值<0 001<0 001

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與DIO4W組比較，○P<0.05；與DIO8W組比較，△P<0.05

2.2 4組下丘腦NPY mRNA表達水平比較 正常對照組、DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平分別為(0.85±0.14)、(1.16±0.15)、(1.53±0.14)、(1.79±0.13)，差異有統計學意義(F=173.320，P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平均高于DIO4W組，差異有統計學意義(P<0.05)；2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平高于DIO8W組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 相關性分析 4組大鼠空腹血清瘦素水平與下丘腦NPY水平、NPY mRNA表達水平均呈正相關(r=0.951、0.953，P<0.05)。

3 討論

2型糖尿病作為一種代謝性疾病已成為人類健康的第三大殺手，預防和治療糖尿病迫在眉睫[11]。瘦素是脂肪細胞分泌的一種調節能量平衡的重要激素，與2型糖尿病發病密切相關[12]。瘦素通過與其受體結合從而發揮中樞性和外周性生物學效應，在中樞瘦素主要通過下丘腦NPY這個中介物發揮作用[13-14]。NPY是由下丘腦弓狀核神經元分泌和產生的，通過刺激進食、抑制產熱和提高胰島素水平來達到能量平衡[15]。大量動物研究表明，下丘腦的NPY神經元上含有瘦素受體，腦室注射瘦素可顯著降低下丘腦NPY mRNA的表達；血清中瘦素水平減少,能使下丘腦NPY分泌增加，使大鼠出現多食、肥胖和血糖增高[16]。故現在認為瘦素與下丘腦NPY構成了瘦素-下丘腦NPY軸，參與攝食，影響糖脂代謝。目前對瘦素-下丘腦NPY軸的研究主要局限于肥胖及2型糖尿病患者，而本研究觀察了2型糖尿病發生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關系。

本研究顯示，在2型糖尿病大鼠模型形成過程中， DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于正常對照組，DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO4W組， 2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO8W組，提示隨著動物體質量的逐漸增加，空腹血清瘦素水平逐漸升高，機體對瘦素的反應減弱或無反應，即發生了瘦素抵抗，與張松筠等[10]的研究一致。本研究還發現，DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平均高于正常對照組，DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平均高于DIO4W組， 2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平高于DIO8W組，提示在2型糖尿病大鼠模型形成過程中，下丘腦NPY 水平及NPY mRNA表達均逐漸增強，且與血清瘦素水平呈正相關。其可能機制與瘦素抵抗有關：瘦素的下游信號(如瘦素受體)出現結構及功能障礙[10]，使其不能正常發揮生理作用，包括對NPY神經元的抑制，于是導致下丘腦NPY 水平上調。NPY是強效的食欲刺激因子，其表達上調可引起大鼠攝食與體質量的明顯增加。

總之，隨著2型糖尿病大鼠模型的形成，下丘腦NPY水平及血清瘦素水平顯著升高，提示瘦素-下丘腦NPY軸功能異常，出現瘦素抵抗。瘦素抵抗對NPY神經元的抑制減弱，使NPY表達水平升高，食欲增加，進一步促進肥胖，加重胰島素抵抗，導致2型糖尿病的形成。但本研究只觀察了上述一種現象，對其具體分子通路方面，還有待進一步研究。雖然還不清楚瘦素-下丘腦NPY軸是否為2型糖尿病的致病因素，但對其在2型糖尿病形成中的變化的研究將有助于對糖尿病發病機制的進一步認識，并為糖尿病的診斷及治療開辟新的途徑。

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