野百合堿對大鼠右心室心肌肥厚功能及規范性瞬時感受器電位6表達水平的影響

蔡克鋒，李維維，徐訓發，林偉強，許朝祥，陳國楨

肺動脈高壓(pulmonary hypertension)是由多種心、肺或肺血管疾病引起的臨床常見病癥，其嚴重危害人類的身體健康，受到醫學界的廣泛重視。肺動脈高壓時因肺循環阻力增加，右心負荷增大，最初右心室出現適應性改變，導致右心室肥厚，有利于維持心排血量，但隨著肺動脈壓的進行性升高，當肺動脈壓升高的速度超過右心室代償能力時，最終導致右心衰竭甚至猝死。因此，逆轉心肌肥厚是當前治療肺動脈高壓研究的重點之一。以往的研究發現，肥厚心肌細胞胞質內Ca2+處于持續性高水平[1]。Ca2+內流能調節細胞內Ca2+濃度，參與細胞的肥大和凋亡，規范性瞬時感受器電位(canonical transient receptor potential，TRPC)亞家族可能參與了這種作用。本研究旨在探討野百合堿(MCT)誘導的右心室肥厚大鼠模型的心肌細胞上TRPC6介導的Ca2+內流是否參與了心肌肥厚的發病，并探討TRPC6在右心室心肌肥厚中的表達及其病理生理學意義。

1 材料與方法

1.1 材料 于2013年2月在上海斯萊克實驗動物有限公司購買健康SD雄性大鼠50只，體質量(200±20)g，周齡(7±1)周。采用隨機數字表法將大鼠分為對照組(CON組)和MCT給藥模型組(MCT組)，各25只。

1.2 方法 CON組大鼠置于常壓和正常氧濃度(21%)飼養箱中飼養3周，MCT組大鼠以2%MCT 60 mg/kg一次性腹腔注射后常規飼養3周。

1.3 血流動力學指標檢測 CON組和MCT組大鼠按照50 U/100 g于腹腔注射肝素，后采取腹腔注射20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg麻醉。切開右側頸部皮膚，分離右側頸外靜脈，將PE50管沿右頸外靜脈送入右心室，記錄大鼠右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)并同步記錄心率(HR)、右心室內壓力最大上升/下降速率(right ventricular pressure maximum rate of rise/descent，RV±dp/dtmax)，同法從左側頸總動脈插入導管，記錄平均動脈壓(MAP)。

1.4 右心室肥大指數(RVMI)計算 剪開大鼠胸腔，剪斷腔靜脈、主動脈以及心臟周圍組織，分離右心室(RV)、左心室(LV)及室間隔(S)，并置于濾紙片上吸干多余水分，分別稱質量并計算RVMI，RVMI=RV/(LV+S)。

1.5 心肌組織形態學檢測 取出大鼠心臟，剪除大血管、心包膜、脂肪組織等，濾紙吸干，取右心室心肌靠心尖部組織，置于4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變。

1.6 實時定量PCR(RT-PCR)檢測TRPC6 mRNA表達水平 將約0.1 g右心室組織塊在液氮中充分研磨后，提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度及純度。用β-actin作為內參照進行RT-PCR，建立10 μl PCR反應體系：H2O 4.15 μl，ROX 5 μl，PCR Forward Primer 0.3 μl，PCR Reverse Primer 0.3 μl(見表1)，cDNA 0.25 μl。PCR擴增反應條件：預變性95 ℃ 10 min，1個循環；95 ℃變性30 s、60 ℃退火1 min、70 ℃延伸 1 min，40個循環。

表1 β-actin及TRPC6 mRNA引物序列

1.7 Western blotting方法檢測TRPC6蛋白表達水平 右心室心肌組織用液氮研磨后，加入RIPA細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，取40 μg總蛋白進行Western blotting實驗。12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后行轉膜印跡，分別用兔抗大鼠TRPC6抗體或大鼠抗大鼠β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)與膜上的抗原結合，然后用相應的辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的二抗與其反應，用化學發光試劑Novex ECL(Invitrogen，美國)檢測，經壓片曝光后顯影和定影。采用Phoretix 1D圖像分析軟件分析蛋白表達情況。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 飼養3周后，CON組大鼠死亡1只，MCT組大鼠死亡7只。CON組大鼠體質量(221±15)g，周齡(10±1)周；MCT組體質量(198±17)g，周齡(10±1)周。兩組大鼠體質量比較，差異有統計學意義(t=4.645，P<0.001)；兩組大鼠周齡比較，差異無統計學意義(t=0.000，P=1.000)。

2.2 兩組大鼠血流動力學指標和RVMI比較 CON組和MCT組MAP和HR比較，差異無統計學意義(P>0.05)；MCT組RVSP、RVMI、RV+dp/dtmax高于CON組，RV-dp/dtmax低于CON組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 兩組大鼠血流動力學指標和RVMI比較

注：RVSP=右心室收縮壓，MAP=平均動脈壓，HR=心率，RV+dp/dtmax=右心室壓力最大上升速率，RV-dp/dtmax=右心室壓力最大下降速率，RVMI=右心室肥大指數

2.3 右心室心肌組織病理學觀察 HE染色可見CON組大鼠右心室心肌細胞排列有序，胞核清晰(見圖1A)。MCT組右心室心肌纖維粗大，細胞內肌原纖維數量增多，心肌纖維排列紊亂，細胞核深染，形狀不整(見圖1B)。

圖1 兩組右心室心肌組織病理切片(HE染色，×400)

Figure1 Pathological sections of right ventricular tissues of the two groups

2.4 兩組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達水平比較 CON組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達水平為(1.00±0.51)，MCT組為(2.49±0.96)，MCT組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達水平高于CON組，差異有統計學意義(t=-3.33，P<0.05)。

2.5 兩組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達水平比較 CON組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達水平為(1.00±0.46)，MCT組為(2.90±0.32)。MCT組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達水平高于CON組，差異有統計學意義(t=14.99，P<0.05，見圖2)。

圖2 TRPC6蛋白在大鼠右心室心肌組織的表達情況

3 討論

MCT屬雙稠吡咯啶生物堿，其進入動物體內后可在肝臟內經P450單氧化酶轉化為有活性的MCT吡咯，可選擇性地損傷肺動脈內皮細胞，使內皮源性NO合成及分泌減少，增加釋放收縮血管物質，如內皮素、血小板源性生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等，引起肺動脈血管腔狹窄甚至堵塞及肺動脈血管收縮，同時由于內皮細胞壞死脫落容易啟動內源性和外源性凝血途徑，形成血栓，最終導致肺動脈高壓[2-3]。肺動脈高壓早期，右心室尚能代償，舒張末期壓仍正常，隨著病情的進展，特別是急性加重期，肺動脈壓持續升高且嚴重，超過右心室負荷，右心失代償，右心排血量下降，右心室收縮末期殘留血量增加，舒張末壓增高，促使右心室擴大、右心衰竭甚至死亡。Tofovic等[4]研究結果顯示，MCT誘導的大鼠肺動脈高壓模型可以模擬人類原發性肺動脈高壓癥的發病過程。本研究結果顯示，肺動脈高壓引起RVSP顯著升高，引起心肌組織代償性肥大，導致RVMI顯著升高，右心室心肌組織切片HE染色可見心肌纖維粗大，細胞內肌原纖維數量增多，心肌纖維排列紊亂，切面可見部分心肌纖維排列擁擠，細胞核深染，形狀不整。RV+dp/dtmax顯著升高，RV-dp/dtmax顯著降低，提示右心室收縮、舒張功能代償性增強，證明MCT誘導3周大鼠右心室心肌肥厚模型成功建立。且此模型方法簡單，可重復性好。

本研究結果證實在大鼠心肌細胞能夠檢測TRPC6表達，且TRPC6 mRNA及蛋白表達水平在MCT組中發生明顯上調。目前已有研究表明，TRPC6通道在心肌肥厚中發揮重要作用[5]。TRPC6是含有931個氨基酸的蛋白，有6次跨膜的結構，其N端和C端均在胞內，第5個和第6個跨膜結構區構成了非選擇性陽離子通道[6]。目前研究發現，TRPC6更多地參與對肺血管緊張度的調節[7]。Kinoshita等[8]研究發現，GC-A基因缺失后的小鼠，由于解除了GC-A對TRPC6的抑制作用引起心臟鈣調神經磷酸酶/激活T細胞核因子(CaN/NFAT)信號通路的激活，從而導致心肌肥厚。本研究以不同的造模方式——MCT誘導，進一步證實TPRC6通道的基因表達上調可能與心肌肥厚有關。

本研究以MCT誘導的大鼠右心室心肌肥厚模型進行研究，結果顯示，MCT可以導致RVSP增高，使右心室心肌收縮和舒張功能增強；MCT組RVMI、TRPC6 mRNA和蛋白表達水平高于CON組，說明MCT可誘導SD大鼠產生右心室心肌肥厚，上調了編碼右心室心肌細胞TRPC6 mRNA和蛋白表達，提示TRPC6可能參與右心室心肌肥厚的發生發展，其可能成為治療肺動脈高壓所致右心室肥厚的新靶點。但本研究采用的MCT誘導右心室肥厚模型是間接通過誘導肺動脈高壓進而導致右心室肥厚而實現的，而MCT對右心室有無直接影響目前尚不清楚，TRPC亞家族其他成員在右心室肥厚中的表達情況如何，尚待進一步研究。

1 Vieillard-Baron A，Frisdal E，Eddahibi S，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP-1 gene transfer or doxycycline aggravates pulmonary hypertension in rats[J].Circ Res，2000，87(5)：418-425.

2 Scotland RS，Chauhan S，Davis C，et al.Vanilloid receptor TRPV1，sensory C-fibers，and vascular autoregulation：a novel mechanism involved in myogenic constriction[J].Circ Res，2004，95(10)：1027-1034.

3 H?gest?tt ED，Zygmunt PM.Cardiovascular pharmacology of anandamide[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2002，66(2/3)：343-351.

4 Tofovic SP，Zhang X，Zhu H，et al.2-Ethoxyestradiol is antimitogenic and attenuates monocrotaline-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling[J].Vascul Pharmacol，2008，48(4/6)：174-183.

5 Nakayama H，Wilkin BJ，Bodi I，et al.Calcineurin-dependent cardiomyopathy is activated by TRPC in the adult mouse heart[J].FASEB J，2006，20(10)：1660-1670.

6 余冬梅.經典瞬時感受器陽離子通道研究進展[J].重慶醫學，2011，40(25)：2591-2593.

7 黃超賢，張萃.TRPC6與疾病研究進展[J].國際醫藥衛生導報，2011，17(6)：765-767.

8 Kinoshita H，Kuwahara K，Nishida M，et al.Inhibition of TRPC6 Channel activity contributes to the antihypertrophic effects of natriuretic peptides-guanylyl cyclase-A signaling in the heart[J].Circ Res，2010，106(12)：1849-1860.