老年男性缺血性腦卒中患者炎性因子血清學水平變化與預后的關系

劉 潤，周 農

近年來隨著人口的老齡化，腦血管病的發病率呈上升趨勢。缺血性腦卒中即為廣義的腦梗死，其發病率占腦卒中患者的60%～70%，主要包括腦血栓形成和腦栓塞[1]。流行病學調查顯示，高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平升高者發生急性腦血管病的幾率是正常健康人的2倍；不同時期性別差異所表現出的卒中風險差異主要與雌激素(E2)有關，外源性E2對缺血性腦損傷的動物模型有保護作用；在動物研究中還發現白介素6(IL-6)與動物腦損傷病情嚴重程度有關[2-9]。然而E2、IL-6和hs-CRP對人類疾病的影響的機制研究目前還尚不成熟，因此本研究選取了IL-6、hs-CRP和E2作為研究指標，探討了其在老年男性缺血性腦卒中患者中的動態變化和機制，并通過NIHSS評分研究患者的神經功能損害與前三者的關系，揭示對早期預后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年4月—2012年6月我院神經內科老年男性缺血性腦卒中患者為研究對象(病例組)，所有抽選的病例年齡60～78歲，平均年齡為(66.3±4.6)歲，均符合第四屆全國腦血管病學術會議制定的缺血性腦卒中診斷標準[10]，且為首次發病，并經顱腦CT或MRI檢查證實。排除標準：既往有明確的基礎疾病史患者，如有冠心病、糖尿病、慢性感染性疾病、結締組織疾病、肝腎功能異常、惡性腫瘤、嚴重營養不良、甲狀腺功能低下、癲癇、周圍血管病等；近期有感染性疾病未愈、創傷或服用激素類藥物史，治療中出現明顯并發癥需抗炎治療干預處理。選取同期體檢合格的健康男性進行匹配(對照組)，匹配條件為年齡相差不超過2歲，近期無創傷或服用激素類藥物史。總共納入38名，年齡60～76歲，平均年齡為(65.8±4.8)歲。病例組與對照組患者年齡相比差異無統計學意義(t=0.94，P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測指標與方法 采用放射免疫分析技術測定血清中E2值。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定標本中IL-6水平。采用終點投射比濁法測定血清hs-CRP水平。

1.2.2 標本采集與準備 所有研究對象均于早晨空腹時采集靜脈血3 ml，置于試管中，經3 000 r/min離心10 min，分離血清后轉入Eppendorf管，低溫(-20 ℃)保存待檢測。病例組患者分別于缺血性腦卒中急性期(發病后第1天、第3天、第7天)及恢復期(發病后第14天、第30天)固定時間段內采集血液樣本進行檢驗。同時采用常規方法檢測患者的總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、血小板、白細胞。對照組標本的采集方法同上，僅于第1天采集。

1.2.3 神經系統評分 對所有入選的缺血性腦卒中患者在治療過程中的意識狀態采用了格拉斯哥昏迷評分(GCS)量表評定意識狀態。對所有入選的缺血性腦卒中患者在治療過程中的神經功能狀況采用美國國立衛生研究院腦卒中量表(NIHSS)評定神經功能狀況。病例組患者分別于缺血性腦卒中急性期及恢復期固定時間段進行相關量表測定。由3人同時對患者評分，取平均分以提高準確性。

1.3 試劑和儀器 (1)IL-6試劑盒由上海恒遠生物科技公司提供；(2)hs-CRP試劑盒購自四川省邁克科技有限責任公司；(3)E2試劑盒由中國科學院原子能研究所提供(使用FT-630G微機多探頭γ計數器)；(4)離心機為LDZ5-2，由北京離心機廠提供；(5)酶標檢測儀為AD450，由美國貝克曼-庫爾特公司提供；(6)洗板機為MW960，由美國貝克曼-庫爾特公司提供；(7)恒溫水浴箱為WS27，由SHELLAB-US公司提供。

2 結果

2.1 病例組急性期指標變化及與對照組比較 交互效應分析結果顯示時間和不同組別之間不存在交互作用(F=1.79，P=0.08)；組別效應有統計學意義(F=7.13，P<0.01)，病例組IL-6以及hs-CRP水平高于對照組(t=15.83，P<0.01)和(t=16.40，P<0.01)，E2水平低于對照組(t=39.76，P<0.01)；時間效應有統計學意義(F=13.80，P<0.01)。見表1。

2.2 病例組恢復期指標變化及與對照組比較 交互效應分析結果顯示時間和不同組別之間不存在交互作用(F=1.66，P=0.20)；組別效應無統計學意義(F=1.17，P=0.24)，時間效應無統計學意義(F=0.74，P=0.46)。見表2。

2.3 相關性分析

2.3.1 患者急性期IL-6、E2以及hs-CRP水平與其他指標相關性分析 采用Pearson線性相關分析法，結果顯示IL-6分別與白細胞計數、GCS評分、NIHSS評分呈相關；E2分別與白細胞計數、GCS評分、NIHSS評分呈相關；hs-CRP分別與白細胞計數、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、GCS評分、NIHSS評分呈相關。見表3。

2.3.2 患者恢復期IL-6、E2以及hs-CRP水平與其他指標相關性分析 采用Pearson線性相關分析法，結果顯示IL-6、E2、hs-CRP分別與NIHSS評分呈相關。見表4。

3 討論

缺血性腦卒中是指突然發生的腦組織局部供血動脈血流灌注減少或血流完全中斷，停止供血、供氧、供糖等，使該局部腦組織崩解破壞，導致卒中后腦損傷，機體發生疾病后會啟動一系列機制來對抗損傷。因次，不論是損傷還是修復，細胞因子都不可避免地參與疾病的過程，必然會帶來部分細胞因子血清學水平變化，本研究同樣發現在老年男性患者發病后細胞因子會產生血清學水平的差異，與病情發展以及預后有一定關系，現做進一步探討。

表1 兩組患者急性期血清IL-6、E2、hs-CRP水平

注：IL-6=白介素6，E2=雌激素，hs-CRP=高敏C反應蛋白

表2 兩組患者恢復期血清IL-6、E2、hs-CRP水平

表3 患者急性期血清IL-6、E2、hs-CRP與其他指標的關系

Table3 The correlation between IL-6,E2,hs-CRP and the other indicators in acute onset phase

指標IL-6r值 P值E2r值 P值hs-CRPr值 P值年齡0 0920 2390 0880 1940 0960 267血小板計數0 0310 6710 0280 5590 0280 556白細胞計數0 4040 0220 3980 0290 1780 037總膽固醇0 0230 5100 0520 5350 2760 062三酰甘油0 0620 3240 0790 4960 320 042低密度脂蛋白0 090 2250 0950 2660 3130 048高密度脂蛋白-0 0710 438-0 0720 442-0 5850 026GCS評分-0 4050 0450 3850 039-0 4280 017NIHSS評分0 8420 016-0 3580 0440 6140 012

注：GCS=格拉斯哥昏迷評分，NIHSS=美國國立衛生院腦卒中量表

表4 患者恢復期血清IL-6、E2、hs-CRP與其他指標的關系

Table4 The correlation between IL-6,E2,hs-CRP and the other indicators in recovery phase

指標IL-6r值 P值E2r值 P值hs-CRPr值 P值年齡0 0980 2710 1050 1780 0850 342血小板計數0 0420 6090 0650 5260 0210 732白細胞計數0 0960 2770 0560 5910 1020 182總膽固醇0 1090 1640 0580 560 0810 304三酰甘油0 0580 5820 0610 5340 0340 673低密度脂蛋白0 1120 1550 0870 2010 0810 351高密度脂蛋白-0 0680 542-0 0620 532-0 0770 476GCS評分-0 1330 1250 0140 972-0 0530 583NIHSS評分0 7250 013-0 3770 0370 7410 011

3.1 腦梗死患者血清IL-6的動態變化與NIHSS關系 IL-6是一種急性反應蛋白，屬于白介素家族。有研究表明患者在卒中后6～24 h內體內白細胞即發生浸潤，1～2 d內中性粒細胞在血清中水平達到最高[11]。通過動物模型研究發現，球囊損傷動脈幾小時后，中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞在損傷部位的動脈外膜處大量聚集[12]。本研究的病例組IL-6水平在第3天時達到最高，在第7天降低，時間效應分析顯示有差異，上述結果提示腦卒中后腦損傷與IL-6有關。患者IL-6水平與年齡、血小板計數、總膽固醇等無相關性，但與白細胞計數、GCS評分、NIHSS評分呈相關，這說明IL-6參與炎性反應。這與Emsley等[13]的研究結論一致。這可能是因為在應激狀態下機體會釋放出信號分子，并通過細胞信號傳導進而激活免疫系統，如T細胞、NK細胞、巨噬細胞等，并逐漸向病灶處釋放炎性因子。有動物實驗發現在大腦中動脈閉塞(MCAO)中，在中性粒細胞浸潤受到抑制時梗死灶體積明顯變小[14]，在耗竭中性粒細胞或抑制黏附分子后，腦缺血與神經功能缺損顯著緩解。本次研究發現在發病后血清IL-6水平較高的患者NIHSS評分較高，提示腦損傷及神經功能障礙嚴重，在第14天、第30天時NIHSS評分同樣較高，神經功能障礙較嚴重，該結論與動物實驗基本相符，說明IL-6對急性期腦損傷嚴重程度有一定提示作用，對早期預后具有不利影響。但另一方面，炎性反應對于恢復期神經恢復可能有益，Dihne等[15]發現，局灶性腦缺血患者在3～7 d IL-6高水平表達區神經元數量最多。由于神經功能障礙是整個神經系統損傷的宏觀表現，包括神經元的損傷和神經網絡結構的破壞，不能由NIHSS評分推測神經組織的壞死或凋亡具體程度和神經網絡結構的缺損度,因此IL-6與后期的關系需要進一步試驗研究。

3.2 腦梗死患者血清hs-CRP的動態變化與NIHSS關系 hs-CRP是在感染和組織損傷時血漿中快速升高的主要急性期蛋白之一。CRP是主要在肝臟內合成的一種急性反應時相蛋白[16-17]。目前認為動脈粥樣硬化的進展和粥樣斑塊的分解破裂等均和炎性損傷有關，而其中hs-CRP與動脈粥樣硬化發生的重要環節密切相關。本研究中病例組在急性期發病第3天時hs-CRP水平達到最高,發病后血清hs-CRP水平較高的患者NIHSS評分高，神經功能缺損嚴重，其原因為腦缺血后腦組織出現病理性改變，直接導致炎性遞質IL-6的釋放，促進了hs-CRP的合成。在第14天、第30天時NIHSS評分同樣較高，通過對hs-CRP水平與神經功能缺損程度及預后進行相關分析發現：hs-CRP越高，預后差；hs-CRP越低，神經功能缺損程度較輕，預后好。這主要是因為hs-CRP水平的增高提高了神經系統血管凝血的幾率。樸海等[18]發現缺血性腦卒中患者腦損傷面積隨hs-CRP水平增加而呈遞增趨勢，神經功能缺損程度隨hs-CRP水平增加而呈遞增趨勢，提示部分炎性因子對于卒中后早期神經恢復不利，間接支持本次研究。Fichtlscherer等[19]研究證實，血清中hs-CRP水平可用來判斷急性缺血性腦卒中患者病情的輕重及預后。Verma等[20]進一步研究發現，在培養的內皮細胞中增加hs-CRP可減少NO的合成。hs-CRP在缺血性腦卒中的形成及進展中起關鍵性作用，雖然現在還沒有根本性藥物能夠降低hs-CRP在血清中的水平，但作為一種炎性反應的標志物在一定程度上能夠反映出炎性反應的輕重，可為缺血性腦卒中預防、診斷、治療及預后提供有價值的信息。由此可見，hs-CRP水平與腦血管病的嚴重程度密切相關，是否可以通過應用抑制其增高的藥物起到穩定粥樣硬化斑塊及減少嚴重腦血管病事件的發生是值得進一步研究的問題。

3.3 腦梗死患者血清E2的動態變化與NIHSS關系 病例組在急性期、恢復期E2水平先降低后升高，E2在與以下單因素如年齡、血小板計數、總膽固醇等無相關性，但E2和NIHSS呈負相關，此結果提示E2與男性缺血性腦卒中有利預后密切相關，E2對男性缺血性腦卒中恢復有積極意義。動物實驗研究發現，大鼠的MCAO模型中，雌性高血壓大鼠腦組織損害體積較雄性及未經E2治療的卵巢切除大鼠腦組織小[3-4]，且皮質和海馬區神經元受損較輕[5]。Solum等[21]研究結果提示大鼠在發育期E2影響海馬神經元的生長、分化和生理功能。E2對血管內皮也具有保護作用，國內楊衛民等[22]在E2的大鼠實驗研究中表明腦缺血2 h后，皮質、海馬及基底核區即出現 Bax、p53蛋白的表達，24 h達到高峰，用E2預處理后可降低其表達，同時誘導凋亡抑制基因 Bcl2的表達明顯，其腦保護作用的劑量依賴與E2對其受體的封閉有關，一定程度上證實了E2可能通過與受體相結合，提高其與特定靶基因相結合的能力，從而誘導或抑制靶細胞特異基因的轉錄。因此，E2對腦損傷具有保護作用得到大多數動物實驗的支持。從本次研究觀察中發現，在男性患者缺血性腦卒中發病后，E2水平均有不同程度的下降，E2水平下降程度較小患者的NIHSS評分較低，神經功能損傷相對較輕，預后較好，這種現象可以用動物實驗研究結果來解釋。結合前面部分對IL-6、hs-CRP的探討，E2在男性缺血性腦卒中患者恢復中的積極作用可能是通過影響白細胞與炎性反應的過程來完成的。本次研究中我們發現男性缺血性腦卒中患者發病后E2水平下降現象，這種改變是E2參與神經修復被消耗還是單純病理性的減少、變化的分子生物學機制、減少對于神經系統和疾病預后的影響以及與其他細胞因子的關系目前仍不十分清楚，仍然是值得研究的問題，需要今后進一步探討。

3.4 男性缺血性腦卒中患者血清IL-6、E2、hs-CRP水平的動態變化及關系 缺血性腦卒中后，由于腦組織缺血壞死，不僅產生大量抗原刺激免疫系統，而且有大量的炎性細胞浸潤和激活，引起強烈的免疫應答過程，使T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核巨噬細胞等被激活，產生大量的IL-6，并參與缺血性腦卒中的病理變化過程。在動脈粥樣硬化過程中，巨噬細胞產生的IL-6等細胞因子誘導hs-CRP產生，所以hs-CRP在腦卒中患者病程中的變化與IL-6類似。一般認為，應激或損傷后早期6～12 h內有一些細胞因子存在短期分泌高峰，然后逐步下降，如IL-6等，這是由于短時間內腦細胞對腦組織缺血引起的瞬時應激反應[23]。但本研究發現老年患者在發病第3天細胞因子水平存在遲發的另一高峰。這可能由于老年患者代謝和生理功能下降、細胞膜表面受體數目減少或受體敏感性下降等諸多原因，導致免疫系統在損傷與應激時合成細胞因子上的遲后與合成能力的下降，引起某些細胞因子分泌高峰的延遲[24]。其次老年患者機體儲備能力下降，這種高峰現象可能會因為機體儲備能力不足而打折或延遲，另外，患者在發病后入院時間上不可能完全一致，因而也可能導致不能完全觀察到6～12 h的分泌高峰。同時發病6～12 h檢測難以整體保證時間的準確，誤差大。在臨床上，通過影像學比較發現，老年缺血性腦卒中患者腦水腫第一高峰常常在發病后第3天開始出現，而腦組織水腫與炎性反應、炎性細胞因子參與是密切相關的，間接提示老年患者存在細胞因子分泌高峰延遲[25]。本次研究中發現在男性缺血性腦卒中患者疾病過程中IL-6與hs-CRP呈早期先升高恢復期逐漸下降的變化規律，此種變化規律與病情的發展規律相一致，通過NIHSS及GCS相關性評價，提示IL-6與hs-CRP在早期腦損傷中的不利影響，與動物實驗研究結果基本一致。而E2在該疾病過程中變化規律恰與前者相反，為早期急劇下降恢復期逐漸升高恢復正常的規律，有一定的反向相關性。從已有的動物實驗中發現 E2能夠抑制炎性因子[26]，在小鼠頸動脈損傷模型中雄性鼠血管內膜的形成大于雌性鼠[27-29]。進一步研究表明，通過注射E2維持其在血液中的生理水平，有利于減少雌雄鼠血管內膜的形成。患者發病后第1天、第3天、第7天的IL-6、E2、hs-CRP 水平與對照組有差異，而第14天、第30天與對照組比較無差異，也就是說發病第1天、第3天、第7天與發病第14天、第30天的IL-6、E2、hs-CRP 水平存在階段性差異，第一個階段機體細胞因子釋放明顯，機體處于應激反應的高水平時期。第一階段IL-6、E2、hs-CRP與部分臨床指標相關，與NIHSS評分相關，而第二階段時與前述部分臨床指標相關性降低，但仍與NIHSS評分相關，提示所研究的整個過程中IL-6、E2、hs-CRP 對NIHSS評分影響密切，明顯影響預后。同時對其他細胞因子與生化指標也是有明顯影響的，這種影響在機體應激反應強烈時尤為明顯，共同影響疾病整個過程。本研究發現血清IL-6、hs-CRP與E2變化有一定的動態關系，推測存在相互影響機制，提示在E2對該疾病過程有一定的有利影響，其發揮作用的某些環節可能與既往動物實驗所闡述的機制有關，臨床可以通過調控E2水平來影響部分炎性細胞因子以減輕腦損傷。國外開展了E2對缺血性腦卒中患者的臨床干預研究，發現在人體身上也有一定腦保護作用[30]。E2發揮對IL-6與hs-CRP的影響可能是其產生有利作用的環節之一，但在人體中詳細機制及與其他細胞因子網絡的關系和在其中所處的位置仍需要進一步研究和證實。

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