埃博拉病毒感染及其實驗室檢查

林迪，孫長貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學檢驗質控中心，浙江杭州310013)

·述評·

埃博拉病毒感染及其實驗室檢查

林迪，孫長貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學檢驗質控中心，浙江杭州310013)

據(jù)世界衛(wèi)生組織官方報道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累計感染1 711人，并致932人死亡。埃博拉病毒是一種能引起人類和靈長類動物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒，該病毒致死率極高，為50%～90%。本文就該病毒的結構、生物學特性、流行病學、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

埃博拉病毒；出血熱；流行病學；感染

埃博拉病毒(Ebola virus)感染人類和非人類的靈長類動物(NHPs)會引起病毒性出血熱、以發(fā)熱為特征的急性系統(tǒng)性疾病、凝血障礙、暴發(fā)性休克和死亡[1]。2014西非埃博拉病毒疫情于2014年2月首次爆發(fā)于幾內亞境內，隨后迅速蔓延，這次疫情中死亡人數(shù)已經(jīng)超過了過去37年的總和，并有失控情況。由于埃博拉病毒的自然宿主至今尚未確定，針對埃博拉病毒感染尚無疫苗、藥物可以預防或治療，雖然一些研究的療法可以減輕埃博拉病毒感染的影響，但目前還沒有FDA批準的用于暴露后人類使用的治療方法[2]。所以疫情控制都集中于對病毒感染者進行維持療法，將他們隔離以限制疫情蔓延。本文就埃博拉病毒相關的結構和生物學特性、發(fā)病機制、流行病學、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

1 埃博拉病毒的結構和生物學特性

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)屬絲狀病毒科，為不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，一般呈長絲狀體，有時也可能出現(xiàn)“U”字、“6”字形、纏繞、環(huán)狀或分枝型，其長度約為19 kb，含有7個基因，依次編碼核蛋白(NP)、病毒蛋白35(VP35)、病毒蛋白40(VP40)、糖蛋白(GP)、病毒蛋白30(VP30)、病毒蛋白24(VP24)和RNA聚合酶(L)[3]。NP主要為核衣殼蛋白質；VP30和VP35功能尚不明確，但通過與MBV比較表明，它可能參與基因復制和基因表達調節(jié)；VP40是一種基質蛋白，參與膜成分和NP的相互作用[4]；GP是通過轉錄編輯鏈接的兩個開放讀碼框ORF1和ORF2編碼，與毒力蛋白結構密切相關；VP24是一種小的膜蛋白，與毒力蛋白結構有關；L蛋白是一種RNA依賴的RNA聚合酶。目前，根據(jù)發(fā)源地和抗原特性可將埃博拉病毒分為五個亞型：扎伊爾型(ZEBOV)、蘇丹型(SEBOV)、萊斯頓型(REBOV)、科特迪瓦型(CEBOV)和本迪布焦型(BEBOV)，除萊斯頓型對人不致病外，其余四種亞型感染后均可導致人發(fā)病。其中ZEBOV和SEBOV對人具有致命性。

埃博拉病毒在常溫下較穩(wěn)定，對熱有中等度抵抗力，56℃不能完全滅活，60℃1h方能破壞其感染性；紫外線照射2min可使之完全滅活；對化學藥品敏感，乙醚、去氧膽酸鈉、β-丙內酯、福爾馬林、次氯酸鈉等消毒劑可以完全滅活病毒感染性；鈷60照射、γ射線也可使之滅活。EBOV在血液樣本或病尸中可存活數(shù)周；4℃條件下存放5周其感染性保持不變，8周滴度降至一半。-70℃條件可長期保存。

2 發(fā)病機制

一些相關研究認為埃博拉病毒感染以炎癥介質的上調為主要特點，如細胞因子、趨化因子、干擾素誘導蛋白和腫瘤壞死因子α(TNF-α，促進細胞凋亡，引發(fā)炎癥，阻止病毒復制，被認為和埃博拉病毒型出血熱的高致死率有非常高的聯(lián)系)[5-10]；此外，跨膜糖蛋白在埃博拉病毒感染中扮演者重要角色，主要發(fā)病機理見圖1[11]。

3 流行病學

1976年埃博拉病毒首次爆發(fā)于蘇丹南部和扎伊爾(即現(xiàn)在的剛果埃博拉河地區(qū))，到目前為止埃博拉病毒呈現(xiàn)明顯的地方間歇性流行，局限在非洲扎伊爾、蘇丹、烏干達、加蓬、南非等地區(qū)[12-14]，非洲以外地區(qū)偶有病例報道，但均屬于輸入性或實驗室意外感染。該病毒季節(jié)性分布不十分明顯，也尚無資料表明不同性別間存在發(fā)病差異。2014年新爆發(fā)于幾內亞的西非埃博拉病毒疫情，經(jīng)德國漢堡Bernhard Nocht熱帶醫(yī)學研究所的Stephan Gunther博士等人通過完整基因組測序和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，來自幾內亞的埃博拉病毒為新型埃博拉病毒株，它形成一個獨立的分支，與目前已知的來自剛果民主共和國和加蓬的埃博拉病毒株并列，由同一祖先平行演變而來[15]。該病毒早期確診病例的病死率為86%，臨床疑似病例的病死率為71%，這與先前的EBOV爆發(fā)的病死率一致[16-18]。

圖1 埃博拉病毒感染主要發(fā)病機理示意圖

據(jù)世界衛(wèi)生組織官方報道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累計感染1711人，并致932人死亡。其中幾內亞感染495例(351例確診病例,133例可能病例，11例疑似病例)，死亡363人；利比里亞感染516例(143例確診病例,252例可能病例，121例疑似病例)死亡282人；尼日利亞感染9例(0例確診病例，2例可能病例,7例疑似病例),死亡1例；塞拉利昂感染691例(576例確診病例，49例可能病例，66例疑似病例)死亡286人。

3.1 傳染源和宿主動物感染埃博拉病毒的人和非人靈長類動物為本病傳染源。雖然到目前病毒還尚未分離到，但狐蝠科的果蝠很有可能是埃博拉病毒的天然宿主，尤其是錘頭果蝠、無尾肩章果蝠和小領果蝠[19]。

3.2 傳播途徑直接接觸感染者和被感染動物的血液、分泌物、排泄物或其他體液，病毒也可經(jīng)黏膜和破損的皮膚進行傳播；醫(yī)務人員在治療、護理病人或處理病人尸體過程中如沒穿戴合適的個人防護設備，也可能會接觸到病毒。

3.3 高危人群醫(yī)務人員、與病人有密切接觸的家庭成員或其他人、在葬禮過程中直接接觸死者尸體的人員和在雨林地區(qū)接觸了森林中死亡動物的人等。

4 臨床表現(xiàn)和病理特點

本病潛伏期為2～21d，典型病例為急性起病，高熱、畏寒、頭痛、肌痛、惡心、結膜充血及相對緩脈。隨后可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、黏液便或血便、皮疹等表現(xiàn)。重癥患者可出現(xiàn)神志改變，如嗜睡、譫妄等癥狀。并可出現(xiàn)不同程度的出血表現(xiàn)，包括鼻、口腔、結膜、胃腸道、陰道、皮膚出血或咯血、血尿等，可出現(xiàn)低血壓、休克等?？刹l(fā)心肌炎、肺炎和其它多臟器受損。

主要病理改變是皮膚、黏膜、臟器的出血，多器官可以見到灶性壞死。肝細胞點、灶樣壞死是本病的典型特點，可見小包含體和凋亡小體。

5 診斷與鑒別診斷[20,21]

5.1 診斷根據(jù)流行病學史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果，可做出埃博拉病毒感染的診斷。

5.1.1 流行病學史來自于疫區(qū)，或3周內有疫區(qū)旅行史，或有與病人、感染動物接觸史。

5.1.2 診斷標準

5.1.2.1 疑似病例具有上述流行病學史和臨床表現(xiàn)。

5.1.2.2 可能病例指經(jīng)臨床醫(yī)生評估的任何疑似病例或無法收集標本進行實驗室確認，并擁有與確診病例相關的流行病學特征的任何已故疑似病例。

5.1.2.3 確診病例疑似病例基礎上具備實驗室檢查任一項檢查陽性者。實驗室檢查陽性者包括：病毒抗原陽性、血清特異性IgM抗體陽性、恢復期血清特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍以上增高、患者標本中檢出埃博拉病毒RNA及患者標本中分離到埃博拉病毒。

5.2 鑒別診斷應與馬爾堡出血熱、克里米亞剛果出血熱、拉沙熱和腎綜合征出血熱等病毒性出血熱，傷寒、惡性瘧疾、病毒性肝炎、鉤端螺旋體病和斑疹傷寒等疾病鑒別。鑒別診斷主要依靠病原學檢查。

6 實驗室檢查

6.1 一般檢查可見白細胞和血小板減少、凝血酶原時間延長和轉氨酶升高(AST＞ALT)，有時可見血清淀粉酶升高，早期可有蛋白尿。

6.2 病原學及相關檢查

6.2.1 電鏡檢查電鏡直接觀察標本培養(yǎng)物上清液中的病毒粒子，根據(jù)病毒粒子的大小、形狀及粒子內的核衣殼鑒定是否為埃博拉病毒。

6.2.2 病毒抗原檢測由于埃博拉出血熱有高滴度病毒血癥，可采用ELISA等方法檢測血標本中病毒抗原。一般發(fā)病后2～3周內，可在患者血標本中檢測到病毒特異性抗原。

6.2.3 病毒核酸檢測對于埃博拉病毒檢測目前主要通過逆轉錄PCR方法檢測病毒RNA。一般發(fā)病后2周內可從病人血標本中檢測到病毒核酸，發(fā)病后1周內的標本檢出率高。目前已有文獻報道使用Real-time PCR檢測埃博拉病毒，該方法檢測蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒標準曲線相關系數(shù)均大于0.99，靈敏度可達1.0×101拷貝/μl，Realtime PCR檢測的敏感度較普通PCR提高106～l07倍，7種其他對照烈性病病原體檢測均呈陰性[3]，其快速、靈敏、特異以及較好的重復性為埃博拉病毒的快速檢測奠定了基礎。Real-time PCR檢測蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒引物和探針序列見表1[3]。Real-time PCR反應體系為25μl，包括：2×預混合液(Premix Ex TaqTM，含有酶、dNTP和Mg2+等成分)12.5μl，ZEBOV或SEBOV上、下游引物各0.5μl (10nmol/L)，探針0.5μl(10nmol/L)，模板1.0μl，用滅菌蒸餾水補足到25μl，混合后進行PCR擴增，擴增條件：95℃，預變性60s；95℃，變性5s；60℃，退火/延伸30s，45個循環(huán)。見表1。

表1 Real-time PCR引物和探針序列

6.2.4 病毒分離采集急性發(fā)熱期患者血標本，用Vero、Hela等細胞進行病毒分離培養(yǎng)，一般發(fā)病1周內血標本病毒分離率高。

6.2.5 血清學檢測據(jù)文獻報道，最早可從發(fā)病后2d的患者血清中檢出特異性IgM抗體，IgM抗體可維持數(shù)月。發(fā)病后7～10d可檢出IgG抗體，IgG抗體可維持數(shù)年。多數(shù)患者抗體出現(xiàn)于起病后10～14d，也有重癥病人始終未能檢出抗體。間隔1周及以上的兩份血標本IgM抗體陽轉或IgG抗體滴度4倍及以上升高具有診斷意義。血清特異性IgM抗體多采用IgM捕捉ELISA法檢測[22,23]；血清特異性IgG抗體多采用ELISA、免疫熒光等方法檢測。

7 結束語

因為埃博拉病毒的高致死率，加上目前尚未有任何疫苗被證實有效，WHO將埃博拉病毒列為生物安全四級病原菌，并被視為潛在的生物戰(zhàn)劑之一。對于埃博拉病毒美國傳染病專家海曼也做出這樣的描述:埃博拉病毒是人類迄今為止未能征服的致命殺手，是世界醫(yī)學界面對的一道難以解讀的“哥德巴赫猜想”。因此，只有深入研究埃博拉病毒的感染機制，才能有利于埃博拉病毒疫苗和藥物的研發(fā)。目前，美國國立衛(wèi)生研究院免疫學家安東尼-弗契帶領的研究小組最新研制出一種可以預防埃博拉病毒感染的疫苗，并實驗證實對猴子完全有效，預計將于今年9月份對人類進行臨床測試。成功研發(fā)疫苗并臨床應用是預防和控制埃博拉病毒感染與傳播的有效手段。

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R373.9

A

1674-1129(2014)05-0495-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.001

2014-08-12；

2014-08-28)

林迪，女，生于1987年10月，本科，技師，從事臨床微生物學檢驗。

孫長貴，男，生于1962年9月，碩士研究生導師，主任技師，教授。