實時熒光定量PCR技術在發育生物學實驗

靳 溪， 薛秀花， 李 潔， 向本瓊

(北京師范大學 生命科學學院， 北京 100875)

0 引 言

發育生物學是在傳統的胚胎學基礎上，綜合分子生物學、細胞生物學、遺傳學和生物化學等多學科, 逐漸發展起來的一門新興學科。主要研究多細胞生物體生殖細胞的發生、受精、胚胎的發育、生長、衰老和死亡，即研究生物胚胎發育和個體發育的機制[1-2]。隨著實驗技術的發展以及多學科的交叉融合，發育生物學研究進展迅速，這對發育生物學實驗課程提出了較高的要求。實驗課程的設計要理論與實踐并重，既需要與理論課程有一定的聯系，又要突出對于學生科學思維的訓練和分析問題、解決問題能力的培養。實驗教學是培養學生動手能力、科學思維和綜合素質的重要措施，只有合理設置實驗教學內容，才有可能提高實驗課程教學效果，實現培養全面人才的教學目標[3-4]。

實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR) 是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，在PCR反應過程中累積熒光信號，實時監測PCR進程，對待測樣品起始模板量進行定量，可用于檢測和比較多種樣本中的微量核酸，包括：mRNA 表達分析、基因定量分析、點突變分析、等位基因分析、單核苷酸多態性分析、DNA 甲基化的檢測及對多種傳染病病原體的定量定性分析等。自1995年該技術問世以來，由于其具有快速、靈敏性高和特異性強等特點，已被廣泛應用于醫學診斷、生命科學、農學、海關檢驗檢疫及國防軍事等領域的研究[5-7]。

我院自2007～2008學年秋季開始，為生物科學專業三年級本科生開設發育生物學實驗課程。該課程核心宗旨是通過實驗幫助學生理解發育生物學理論，提高學生自主實驗技能。對于每一學年的實驗課設置，任課教師都會結合課程要求和學生特點，安排新的實驗教學內容。由于易于手術操作、便于觀察，雞胚是發育生物學研究的經典實驗模型[8]。多年來，在我院發育生物學實驗動物部分課程中，雞胚是主要的實驗材料之一。近年來，實時熒光定量PCR技術的應用已十分普遍，雖然有些課程簡單介紹過該項技術，但均缺乏實踐操作環節。為了讓本科生從分子水平理解雞胚發育，同時，從理論到實踐全面了解實時熒光定量PCR技術，本學年設計了結合綜合性和探索性的實驗內容應用于發育生物實驗課教學，以激發學生的獨立思考能力和自主學習積極性，提高學生的實踐能力和科學素養。實驗內容教學效果良好。

1 教學安排

(1) 課時分配。樣品總RNA提取、鑒定、反轉錄模板共計8課時，實時熒光定量PCR實驗操作及結果分析共計8課時。

(2) 實驗分組。全班共4個小組，每個3或4人。

(3) 課程作業。授課前，要求學生預習定量PCR實驗，自學實驗原理。查閱文獻，假設一個與雞胚發育相關的待檢測基因，每組設計一個實驗方案。

實驗課上，講授實驗原理，提供一個標準的實驗方案讓學生進行操作，討論學生自己設計的實驗方案，給出意見和建議。

授課后，要求學生提交實驗報告，課上進行實驗結果交流和討論。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料收集

在進行雞胚發育觀察實驗的同時，于雞胚發育的第10 d、15 d和20 d，每個小組在進行雞胚發育形態學觀察之后，分別采集雞胚的腦組織和心臟組織，收集于2 mL凍存管，放置液氮罐保存。

2.2 PCR模板樣品制備

(1) RNA提取。參照TIANGEN?動物組織總RNA提取試劑盒說明書。

(2) RNA濃度測定。GE?NanoVue。

(3) RNA純度測定。凝膠電泳。

(4) 反轉錄PCR。挑選經過鑒定濃度和純度符合要求(凝膠電泳結果顯示條帶完整，OD260/OD280介于1.8～2.0)的RNA樣品進行反轉錄，參照TAKARA?反轉錄試劑盒說明書。

2.3 熒光定量PCR

(1) 引物[9-10](見表1)。

表1 引物信息

(2) 反應體系。滅菌水8 μL ，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，模板1 μL，定量Mix(2×)10 μL。

(3) 反應程序(ABI7500)。95℃ 5 min，95℃ 15 s—60℃ 30 s(循環數33)， 72℃ 35 s，熔解曲線分析程序。

(4) 結果分析。

3 實驗結果與分析

綜合全班實驗數據，實驗結果見圖1。

(1) 由于本實驗從樣本采集、RNA提取、鑒定、反轉錄到最后進行熒光定量PCR實驗步驟較多。實驗過程中，有的同學遺失樣本，有的同學提取的RNA質量不合格，不能用于實時熒光定量PCR實驗，因此雞胚發育第10 d腦組織樣本實驗結果缺失。

(2) 目前應用雞胚作為實驗材料檢測發育階段GABAAreceptor γ3基因表達情況的文獻報道較少。本次學生實驗結果顯示，在雞胚腦組織中，該基因mRNA在雞胚發育第20 d比第15 d表達上調，這種表達變化的趨勢與Zaker等[10]研究報道一致。在雞胚心臟組織中，與雞胚發育第10 d相比，該基因mRNA在雞胚發育第15 d表達下調，第20 d表達上調。這些結果尚需重復實驗驗證才能得出結論。

圖1 實驗結果* 與10 d樣品相比，P<0.05；# 與15 d樣本相比，P<0.05

(3) 本次實驗是探索性教學實驗，由本科生為主體，綜合一系列實驗而最終獲得結果，并且只是全班進行了一次課堂上的實驗，匯總得到結果，可能存在實驗操作誤差。尚需重復實驗才能最終得出科研性結論。

4 教學意義

從課程建設和本科生教學實踐的角度考慮，此次實驗教學是成功的。通過該實驗的教學探索，為課程建設打下基礎，讓學生得到鍛煉和收獲。主要體現在以下幾點。

4.1 強化理論知識，鍛煉操作技能

通過實踐本實驗設計內容，學生普遍反映與單純講授實時熒光定量PCR技術相比，通過實驗操作，對該技術有了更清晰的認識，不但理解了技術原理，還通過實際操作，學習了數據的分析方法。

學生通過預習、自主設計實驗、課堂實踐、實驗報告撰寫等環節，經歷了一個相對完整、獨立的科研實驗過程，拓寬知識面，提高綜合實驗能力。通過這樣的實踐，有助于樹立學生的科學思維和嚴謹態度、鍛煉學生獨立思考、培養學生的創新能力。從樣品采集到最后的結果分析，該實驗設計包含了多個基本實驗，學生通過逐一完成每個實驗，了解了實驗基本原理，熟悉了操作步驟。既培養學生動手操作能力、科研分析及解決問題的能力，也充分調動了學生的積極性[11]。

在實驗中，學生會遇到各種各樣的問題，各個同學和小組之間要分工合作，這樣的過程，提供給學生一個發現問題、思考問題、解決問題的機會，激發學生學習興趣，培養學生的責任感和團隊合作精神。教學實踐中，學生成為實驗課程的主體，教師從旁輔導指引，充分調動學生的主動性、積極性和創造性。

4.2 合理安排實驗，善待實驗動物

實時熒光定量PCR技術應用于發育生物學實驗課，涉及到一系列的實驗和操作，這對學生的實驗設計和科研計劃能力提出了一定的要求。本實驗中，實驗材料的收集安排在雞胚發育觀察實驗之中，這訓練了學生科學管理實驗材料，合理利用實驗材料，規劃實驗時間安排的能力。在教學實踐中，出現學生忘記收集實驗材料，學生保存的實驗材料由于標記不清無法確定樣品來源，實驗步驟安排失誤導致實驗時間延長等各種情況，這對于學生都是很寶貴的教育過程。通過錯誤來學習是認知方式之一，課堂是學生獲得知識、鍛煉能力的場所，實驗課提供給學生的正是這樣的機會。通過實時熒光定量PCR實驗的教學實踐，一方面鍛煉了學生統籌實驗的能力；另一方面，幫助學生樹立善待實驗動物的理念，在進行完雞胚發育形態學觀察之后，收集實驗材料，既不會造成新的雞胚犧牲，還能充分利用已有實驗材料。

4.3 積累教學資源，完善課程設置

通過實時熒光定量PCR技術在發育生物學實驗的教學實踐，為發育生物學的綜合性實驗設計及探索性實驗項目提供參考。雞胚發育實驗是我院開設發育生物學以來一直很重視的實驗內容之一，如何豐富該實驗的內容，使學生更好的理解發育原理一直是發育生物學實驗課程希望完善之處。通過本次教學實踐，為學生從分子水平觀察雞胚發育提供了可能。

發育生物學實驗是我院生物科學專業本科生在本科階段最后一門實驗課程，之所以安排在大三學年，就是因為發育生物學實驗是一門綜合性很強的課程，并且，正處于快速發展階段，新的研究技術和方法不斷被應用、新的理論觀點不斷被提出。因此，就要求任課教師思考如何合理有效的設置課程，既要考慮到與理論課程的有機結合，也要兼顧發育生物學實驗的綜合性。

將實驗技術應用于科研，其可操作性相對較強，但要使其成為實驗課的教學實驗，需要經過不斷的摸索和改進，使之適應教學實驗的特點[12-13]。本次實踐為以后在發育生物學實驗課設計開展實時熒光定量PCR實驗模塊奠定了基礎。只有不斷嘗試，勇于開拓，才能將理論與實踐、科學研究與教學實驗更好地結合。

5 結 語

在生命科學快速發展的今天，發育生物學實驗課程面臨著機遇和挑戰。為培養全面發展的高素質本科人才，教師要不斷更新教育教學理念，不斷創新教學方式方法，課前要認真研究課程內容，基于學生已有知識基礎，合理設置實驗課的教學內容，積極了解學生反饋意見，并進行必要的調整。從而改善教學質量，鍛煉學生的綜合能力，提高教師的業務能力和科研水平，形成教學相長良性互動的局面，以適應新時期人才培養和社會發展的需求[14-16]。唯有經過不懈努力和持久開拓，才能實現發育生物學實驗課程的日臻完善。

(致謝:感謝北京師范大學生命科學學院翟永功教授對本實驗設計和實施方案提供的意見和建議。感謝北京師范大學生命科學學院張雁云教授在文章發表過程中給予的支持和幫助。感謝研究生助教許鵬飛和樊蓉在預實驗和課堂教學時的協助指導。)

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