白馬雪山牧場中捕食線蟲真菌資源調查

蘇錫鈞，羅宗龍，朱 丹，劉碩然，蘇鴻雁

（大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

白馬雪山牧場中捕食線蟲真菌資源調查

蘇錫鈞，羅宗龍，朱 丹，劉碩然，蘇鴻雁*

（大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

目的：調查白馬雪山牧場中捕食線蟲真菌資源及其在不同基質中的分布情況。方法：2012年8月份從白馬雪山牧場中采集了97份牦牛糞樣，95份土壤樣品，進行捕食線蟲真菌的分離培養及鑒定。結果：共分離出4屬16種捕食線蟲真菌，其中1種未定名，Arthrobotrys oligospora和Arthrobotrys thaumasium在土壤樣品及牦牛糞便中都出現，頻率較高。結論：土壤中的捕食線蟲真菌比牦牛糞樣中的豐富，具有三維菌網的Arthrobotrys屬菌株出現頻率較高。

白馬雪山；牦牛糞便；捕食線蟲真菌；土樣；資源

動物寄生線蟲對畜牧業養殖危害較大并造成巨大損失〔1〕。長期以來，對家畜線蟲病的防治主要是采取合理的放牧管理和以化學藥物（如阿苯達唑）防治為主〔2〕。長期使用化學藥物會產生以下不良問題，如藥物在動物產品肉、蛋、奶中殘留、蟲體產生抗藥性、藥物在環境中殘留以及藥物代謝產物影響生態環境安全等。由于絕大多數化學藥物僅對成蟲起作用，對蟲卵及幼蟲無能為力，所以，人們一直在尋找新的防治方法。其中，生物防治最被人們推崇，被認為是最有效和最環保的措施之一。

線蟲的天敵——捕食線蟲真菌（nematode-trap?ping fungi）是目前研發寄生線蟲生防制劑的重要資源〔3〕。在新西蘭，澳大利亞等畜牧業發達的國家，利用捕食線蟲真菌防治動物寄生線蟲病取得了一定進展〔4-6〕。如Athrobotrys flagrans已被開發成生防制劑，并成功用于防治家畜寄生線蟲〔7-9〕，展示了利用捕食線蟲真菌防治家畜寄生線蟲的巨大潛力。

牦牛（Bos spp.）是分布于青藏高原其毗鄰的高山、亞高山地區的典型高山高寒荒漠動物。本項目對白馬雪山牧場牦牛糞便及比鄰土壤中捕食線蟲真菌資源進行調查，結果將為家畜寄生蟲生物防治提供適宜本地生防需要的菌株資源。

1 材料和方法

1.1牦牛糞樣及土壤樣品采集地點云南省維西塔城白馬雪山牧場位于東經98°47′～99°21′，北緯27°25′～28°36′之間，海拔2 200～4 100 m，多為高山寒漠土和亞高山草甸土，屬季風氣候，干濕季節明顯，長冬無夏，春秋短暫。冬半年（11月份到第二年4月份）天氣晴朗，日照充足，風速較大，降水少，濕度小，氣溫日差較大，呈現干季氣候特征。而5～10月份，日照少，云量多，降水集中，形成濕季。

1.2采集樣品2012年8月15日在白馬雪山牧場中隨機采集新鮮牦牛糞樣品97份，放入無菌封口袋；再以牦牛糞便為中心，20 cm半徑的范圍內采集土壤樣品95份，每份樣品約30 g，放入無菌封口袋，帶回實驗室處理。在室溫下，7 d內處理完糞樣，20 d內處理完土樣。

1.3 CMA的制備稱取25 g玉米粉，加水1 000 mL煮沸約30 min，用4層紗布過濾，再向濾液中加入18 g瓊脂粉，加水至1 000 mL，混勻，自然pH，分裝到500 mL錐形瓶內，在121℃條件下滅菌30 min。

1.4誘餌線蟲Panagrellus redivivu的培養和制備

培養：用燕麥片制成的培養基培養誘餌線蟲。制備：取少許線蟲置于2層擦鏡紙上置于漏斗（漏斗通過軟管與收集管相接），加適量無菌水，擠壓軟管排除氣泡，靜置約1 h，取離心管內的濾出物，加無菌水把線蟲濃度稀釋到約為2×104～3×104條∕mL。

1.5捕食線蟲真菌的分離及捕器誘導

1.5.1 優化誘餌平板法（Baited plates） 用滅過菌的牙簽挑取約3 g樣品到CMA平板上進行點狀灑樣，每個樣品重復2次，灑樣后每皿加入約5 000條線蟲做誘餌。為了便于鏡檢及單孢分離時減少污染，撒樣時，距皿邊緣l cm左右，樣品間留適當空隙。在室溫下培養4周后，解剖鏡下鏡檢每個平板，觀察捕食線蟲真菌。觀察到的捕食線蟲真菌用無菌方法采用單孢分離技術，在酒精燈下迅速轉接到60 mm CMA平板上，在25℃培養箱或室溫下培養，培養時間為2～3周。

1.5.2 捕器誘導 在純培養的CMA平板中央切除1 cm×l cm的培養基，滴加誘餌線蟲懸液（約20～100條線蟲），25℃溫箱培養。對在CMA平板上難于產生捕器的菌株，將其純培養轉接到WA平板上，待平板長滿孢子后再接入誘餌線蟲。

1.6捕食線蟲真菌的鑒定捕食線蟲真菌單孢純化后，用斜插蓋玻片法或牙簽挖洞法〔10〕觀察誘導捕器，在Olympus BX51顯微鏡下觀察形成的各種捕食器類型，確定分生孢子及孢子梗的形態大小、著生方式，測量分生孢子的大小、計算各分隔數占的比例，采用Li Yan等〔11〕分類系統進行鑒定，確定其屬、種。

1.7捕食線蟲真菌檢出率及統計檢出率（Occur?rence frequency，OF）%=含有某一種物種的樣品數∕所有的樣品數×l00%。

2 結果

白馬雪山牧場中捕食線蟲真菌資源調查結果見表1。從表1可知，從97份牦牛糞樣中分離出捕食線蟲真菌6種，均屬Athrobotrys屬；從95份土壤樣品中分離出捕食線蟲真菌14種，分屬Athrobotrys、Drechslerella、Dactylellina和Dactylella 4屬。從兩種樣品中共分離到16種（含未知種1種，擬結合現代分子手段進行分類，DNA測序及相關工作正在進行中）捕食線蟲真菌，其中Athrobotrys oligospora和Athrobotrys thaumasium在兩種樣品中均有較高的檢出率。此外，土壤中的捕食線蟲真菌較牦牛糞樣中豐富，Arthrobotrys屬的菌株出現頻率較高。

表1 白馬雪山牧場土壤和牦牛糞樣中捕食線蟲真菌資源調查結果

3 討論

白馬雪山牧場土壤樣品中的捕食線蟲真菌檢出率明顯高于牦牛糞樣中的捕食線蟲真菌的檢出率。這可能是因為牦牛消化道屬于厭氧環境，消化道內溫度高于外界環境、酸性比土壤強，牦牛進食時隨食物所吃進的捕食線蟲真菌分生孢子通過消化道后，有部分不能存活，從而使得土壤中捕食線蟲真菌檢出率比糞便中高。

由于Arthrobotrys屬的捕食器為三維菌網，腐生性較強，生長速度較快，所以在白馬雪山牧場中土壤樣品及牦牛糞便中Arthrobotrys屬菌株出現頻率較高，為優勢菌群，與繆作清等〔12〕、蘇鴻雁〔13〕的研究結果一致。

〔1〕蔡進忠.青海省反芻家畜寄生線蟲的分類整理〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2006，24（S1）:68-72.

〔2〕張德洪，陳亞偉，李明惠，等.阿苯達唑驅蟲治療出現膽道蛔蟲癥一例報告〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1992（4）:306.

〔3〕張克勤，莫明和.中國真菌志，節叢孢及相關屬〔M〕.北京:科學出版社，2006：156.

〔4〕LARSEN M，FAEDO M，WALLER P J.The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep:survey for the presence of fun?gi in fresh faeces of grazing livestock in Australia〔J〕.Vet?erinary Parasitology，1994，53（3）:275-281.

〔5〕LARSEN M，NANSEN P，WOLSTRUP J，et al.Biological control of trichostrongyles in calves by the fungus Dudding?tonia flagrans fed to animals under natural grazing condi?tions〔J〕.Veterinary Parasitology，1995，60（3）:321-330.

〔6〕EYSKER M，BAKKER Y，HALL I，et al.The impact of daily Duddingtonia flagrans application to lactating ewes on gastrointestinal nematodes infection in their lambs in the Netherlands〔J〕.Veterinary Parasitology，2006（141）:91-100.

〔7〕WAGHORN T，LEATHWICK D，HEN L，et al.Influence of nematophagous fungi，earthworms and dung burial on de?velopment of the free-living stages of Osertagia（Tekadirsa?gua）circumcincta in New Zealand〔J〕.Veterinary Parasi?tology，2002（104）:119-129.

〔8〕DIMANDER S，HOGLAND J，UGGLA A，et al.Evalua?tion of gastro-intestinal nematode parasite control strate?gies for first-season grazing cattle in Sweden〔J〕.Veteri?nary Parasitology，2003（111）:193-209.

〔9〕TERRIL T，LARSEN M，SAMPLES O，et al.Capbility of the nematode-trapping fungusDuddingtonia flagrans to re?duce infective larvae of gastrointestinal nematodes in goat faeces in the southeastern United States:does titration and does titration and does time interval studies〔J〕.Veterinary Parasitology，2004（120）:285-296.

〔10〕蘇鴻雁，李明，劉曉軒.捕食線蟲真菌玻片制作方法的改進〔J〕.大理學院學報，2006，5（6）:25-26.

〔11〕LI Y，HYDE K，JEEWON R，et al.Phylogenetics and evolution of nematode-trapping fungi（Orbiliales）esti?mated from nuclear and protein coding genes〔J〕.Mycolo?gia，2005，97（5）:1034-1046.

〔12〕繆作清，劉杏忠.捕食線蟲真菌在北京地區果園中的季節性分布〔J〕.菌物系統，2003，22（1）:77-81.

〔13〕蘇鴻雁.中甸打日壩牧場捕食線蟲真菌資源調查及其季節性分布〔J〕.楚雄師范學院學報，2006，26（1）:54-57.

*通信作者：蘇鴻雁，教授.

（責任編輯 毛本勇）

Investigation on the Nematode-trapping Fungi in Baima Snow Mountain

SU Xijun,LUO Zonglong,ZHU Dan,LIU Shuoran,SU Hongyan*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Objective:To investigate the species and distribution of nematode-trapping fungi in Baima Snow Mountain.Methods:97 yak dung and 95 soil samples were taken from Baima Snow Mountain in August 2012 which were followed by isolated culture and identify work in lab.Results:16 species including 1 unnamed species which belongs to 4 categories were isolated from samples. Among the isolated species,Arthrobotrys oligospora and Arthrobotrys thaumasium both were found in soil and yak dung with high occurrence.Conclusion:The species isolated from soil samples were much richer than yak dung.Species with adhesive nets were high frequently found.

Baima Snow Mountain;yak dung;nematode-trapping fungi;soil;resource

Q948：S154.3

A

1672-2345（2014）06-0071-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.06.018

國家自然科學基金資助項目（31060019;31100093; 31360013）;云南省教育廳重大專項資助項目（ZD2010010）;云南省中青年學術帶頭人資助項目（2012HB-042）;云南省高校滇西生物多樣性科技創新團隊基金資助項目（云教函〔2011〕93號）;大理學院質量工程項目（TDⅠ-05）

2013-09-04

2013-12-30

蘇錫鈞，實驗員，主要從事菌物學研究.