大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離培養與鑒定

李蘭蘭　陳玲肖　馬炬明

[摘要] 目的 建立大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）體外分離培養方法。方法 采用全骨髓貼壁法分離培養BMSCs，進行形態學觀察，繪制生長曲線，流式細胞儀分析細胞周期、檢測細胞表面抗原標志物，并進行成脂、成骨分化誘導。 結果 獲取的BMSCs形態呈均一成纖維細胞樣，并呈集落樣生長。生長曲線呈S形，細胞周期顯示86.02% P3代細胞為G0/G1期，保持活躍的擴增能力。BMSCs 高表達CD44、CD90、低表達CD34、CD45。成脂誘導21 d后，可見細胞的胞漿內出現大量紅染脂滴。成骨誘導21 d后，可見大量橘紅色礦化結節形成。結論 全骨髓貼壁培養法可成功有效地分離培養BMSCs。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞；全骨髓貼壁法；鑒定

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）01-0007-04

BMSCs具有高度增殖的能力、體外基因轉移效率高以及多向分化潛能等優點[1-2]，使其成為組織工程、細胞替代治療等領域的首選種子細胞。但是骨髓中的間充質干細胞含量極低[3]，且其含量隨年齡增長而逐漸減少[4]，需經體外分離、純化、擴增為純度高、活力強、生物特性均一的間充質干細胞才能滿足組織工程需求。實驗旨在建立一套簡便有效的BMSCs原代培養方法，為后續實驗做好準備。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠6只，4周齡，體質量100 g，由浙江省實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2 時間及地點

于2013年1～6月在中國人民解放軍第一一七醫院干細胞治療中心完成。

1.3 實驗主要試劑

低糖DMEM培養基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/鏈霉素（吉諾生物），優質胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導分化培養液、茜素紅、油紅O（Cyagen公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的原代分離培養 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，置于75%的乙醇中浸泡7 min。無菌條件下分離股骨和脛骨，眼科剪切除兩端骨骺，用2.5 mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養液沖洗骨髓腔，待骨髓腔變白。充分吹打混勻，經200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊。收集細胞懸液于15 mL離心管中，400 g室溫離心5 min。離心后去上清，用5 mL完全培養液重懸，混勻，轉移至25 cm培養瓶中，置于37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中培養。2 d后首次全量換液，以后每3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態與生長情況。

1.4.2 BMSCs的純化擴增 待細胞融合至80%開始傳代，PBS沖洗。加入1.0 mL預熱的0.25%胰酶-0.02%EDTA，輕輕搖動培養瓶，室溫孵育0.5 min，待鏡下胞質回縮后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，并輕輕吹打培養瓶底。將細胞懸液轉移至15 mL離心管，400 g室溫離心5 min，棄上清，完全培養液重懸，以1∶2或1∶3比例進行傳代培養。此時細胞記為P1，以后每周換液2次，待細胞融合達80%后，重復上述步驟進行傳代，依次記為P2、P3等。

1.4.3 BMSCs 的生長曲線測定 取生長良好的第3代細胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA常規消化，以2×104/mL 接種于24孔板，每天取3孔消化計數，每孔計數3次，計算均值，連續8 d。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪生長曲線。

1.4.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取生長狀態良好的第3代BMSCs，常規消化，制成單細胞懸液，將200 μL 4℃預冷的乙醇與細胞懸液均勻固定，室溫孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，盡量避免產生氣泡，室溫孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

1.4.5 流式細胞儀檢測細胞表面標記 待第3代BMSCs融合至80%，常規消化制成單細胞懸液，分裝至EP管中。于待檢測的樣本中各加入100 μL PBS重懸，分別加入CD34，CD44，CD45，CD90一抗及同型對照10 μL，充分混勻，室溫避光孵育30 min后，用PBS洗滌2次，400 g，室溫離心5 min，棄上清，每測試管加500 μL PBS，充分混勻，流式細胞儀檢測。

1.4.6 成脂肪細胞誘導分化 待培養的P3 BMSCs生長至80%融合，常規消化，以2×105/孔密度接種于6孔培養板，每3天換新鮮的基礎培養液，待細胞完全融合后，實驗組加入2 mL成脂肪誘導分化培養液A，3 d后將分化誘導液換為成脂肪誘導分化培養液B，1 d后再換回成脂肪誘導分化培養液A進行誘導，如此循環3～5次后，用成脂肪誘導分化培養液B繼續維持7 d，每3天進行換液，對照組加入等量基礎培養液。倒置顯微鏡下觀察細胞形態與生長情況，21 d后進行油紅O染色。

1.4.7 成骨細胞誘導分化 待培養的P3 BMSCs生長至80%融合，常規消化，以3×104/孔密度接種于6孔培養板（培養皿底部有明膠包被），常規培養1 d后，細胞達50%～70%融合，實驗組加入2 mL成骨誘導分化培養液，對照組加入等量基礎培養液，每3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞形態與生長情況。成骨誘導21 d后進行茜素紅染色。endprint

2 結果

2.1 BMSCs的形態學觀察

剛接種時細胞懸浮于培養液中，呈圓形，大小不一，折光性較強。48 h首次換液后可見大量細胞貼壁，形態不一，部分伸出偽足。三四天貼壁細胞數量增多，細胞偽足增長呈短梭形。五六天細胞增殖迅速呈克隆樣生長的集落。八九天左右細胞形態基本為長梭型細胞，縱軸相互平行排列，一般可達到80%的細胞融合狀態。傳代細胞接種4 h后基本完全貼壁，很快鋪展。細胞增殖速度較原代快，呈均勻分布的紡錘形，五六天即可傳代，見圖1。

圖1 P3 BMSCs培養5 d，×100

2.2 BMSCs的生長曲線

接種后，BMSCs經過1～2 d的潛伏適應期后進入對數增殖期，第7天達頂點，隨后進入平臺期（平均細胞計數依次為2、2.22、2.44、3.33、5.67、7、8.22、8.11×104/孔），生長曲線呈S形，符合正常細胞的生長特性，見圖2。

2.3 細胞生長周期

流式細胞儀檢測結果顯示，第3代BMSCs中G0/G1期細胞為86.02%，G2期細胞為5.41%，S期細胞為4.90%，見圖3。

圖3 P3 BMSCs細胞周期

2.4 BMSCs表面標記物的表達

流式細胞儀檢測結果顯示，細胞CD44、CD90陽性率分別為96.2%、97.9%，CD34、CD45陽性率分別為0.3%、0.9%，驗證此細胞為BMSCs，純度較高，見圖4。

2.5 誘導分化鑒定

成脂誘導后細胞逐漸由梭形變為圓形，油紅O染色可見橙紅色折光性強的脂滴，呈圓形，定位于胞漿，見圖5A。成骨誘導后細胞外基質分泌逐漸增多，局部細胞呈重疊生長，染色后可見大量橘紅色致密結節形成，見圖5B。對照組均呈陰性染色。

A：實驗組油紅O染色；B：實驗組茜素紅染色

圖5 多向分化功能鑒定（×100）

3 討論

BMSCs是一種存在于骨髓間質內的非造血系成體干細胞，可以自體取材，具有多向分化潛能，無倫理學限制。目前分離方法主要包括密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀分離法及免疫磁珠分離法[5]。后兩種方法分離的細胞純度較高，但價格昂貴，對細胞活性有較大影響，目前應用較少。楊麗等[6]研究發現，全骨髓貼壁法比密度梯度離心法更加簡單實用，降低了離心對細胞的損害，分離的細胞貼壁時間短，增殖快。考慮離心過程中，丟失了促進BMSCs貼壁的一些生長因子及促黏附物質，改變了骨髓中原有的微環境，所用的分離液對細胞有一定的毒性作用，影響細胞的活性。林楚偉[7]等證實全骨髓貼壁加差速傳代法分離培養的BMSCs生長增殖活力強于密度梯度離心法。張君紅[8]等觀察到使用SD雌性大鼠分離后的細胞懸液含有較多脂滴，貼壁細胞不牢固且傳代困難，可能與雌、雄性大鼠體內的雌、雄激素等水平存在差異有關。

全骨髓貼壁法是利用BMSCs對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細胞，進行分選純化。利用BMSCs較巨噬細胞、單核細胞等易于消化的特點，嚴格掌握消化酶的量及消化時間，發現細胞間隙增大后，應立即消化，輕柔吹打，盡量避免出現氣泡。注意傳代時的細胞融合程度，避免細胞接觸抑制，延緩細胞老化的時間。BMSCs生長時密度依賴性極強[9]，注意傳代細胞的種植密度。首次傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環境。

多數學者認為采用形態學觀察、增殖能力、表面標志及多向分化的特點進行逆向推斷是否為BMSCs[10]。大量的研究表明BMSCs表達CD29、CD44、CD71、CD73、CD90和CD105等表面標志，不表達造血細胞的表面標志如CD14、CD34、CD45、CD106等[11]。本方法所培養細胞為貼壁生長細胞，呈長梭形、紡錘形等成纖維細胞形態，大小比較均一，呈“漩渦狀”生長。細胞生長曲線呈S形，經歷潛伏適應期、對數增殖期、平臺期，符合正常細胞的生長特性。流式細胞儀檢測結果提示大多數BMSCs處于靜止期，保持自我更新和增殖潛能，約10%處于功能期，具有強大的分化增殖能力。高表達細胞表面抗原CD44、CD90，低表達CD34、CD45，能向成骨、成脂分化，具有多向分化潛能，符合國際細胞治療學會間充質及組織干細胞委員會提出的鑒定動物來源BMSCs的三條最低標準，為下一步探討BMSCs逆轉肝纖維化的機制提供功能穩定的種子細胞。

盡管對間充質干細胞的研究已很深入，但其缺乏特異性表型標志物，如何準確簡便地鑒定BMSCs以及其體外分化誘導機制尚不清楚，還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Chamberlain G，Fox J，Ashton B，et al. Concise Review：Mesenchymal stem cells their phenotype，differentiation capacity immunological features and potential for homing[J].Stem Cells，2007，25（11）：2739-2749.

[2] Lysy PA，Campard D，Smets F，et al. Persistence of a chimerical phenotype after hepatocyte differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Cell Prolif，2008， 41（1）：36-58.

[3] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science，1999，284（5411）：143-147.endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質干細胞穩定分離培養體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優優. 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養大鼠骨髓間充質干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質干細胞穩定分離培養體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優優. 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養大鼠骨髓間充質干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質干細胞穩定分離培養體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優優. 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養大鼠骨髓間充質干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint