200 mmol/LHS對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織氧化應(yīng)激及PBMCs中p38MAPK活性的影響

高 智，吳雪生，孫業(yè)祥，陳旭林，王 飛

200 mmol/LHS對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織氧化應(yīng)激及PBMCs中p38MAPK活性的影響

高 智1，吳雪生2，孫業(yè)祥1，陳旭林1，王 飛1

目的探討200 mmol/L高滲鹽液（HS）對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織的氧化應(yīng)激以及外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活性的影響。方法按照隨機(jī)抽樣法將SD大鼠劃分為3組：對照組（8只）、乳酸鈉林格液組（LR組，24只）以及高滲鹽液組（HS組，24只）。燙傷前48h 3組大鼠均予以頸靜脈置管，對照組的大鼠直接處死取材。LR組和HS組的大鼠在經(jīng)過30%體表面積燙傷（TBSA）后分別予補(bǔ)充LR與HS進(jìn)行復(fù)蘇治療，并分別于燙傷補(bǔ)液后2、8、24h處死取材。檢測3組大鼠腸組織中髓過氧化物酶（MPO）的活性與丙二醛（MDA）的含量，分離各組的PBMCs并采用Western blot法檢測細(xì)胞中p38MAPK的活性，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果與對照組相比，HS組及LR組腸組織中MPO活性和MDA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），HS組與LR組相比傷后各時間點(diǎn)上腸組織MPO活性與MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），而HS組和對照組相比傷后3個時間點(diǎn)上腸組織MPO活性與MDA含量無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HS組與LR組復(fù)蘇后各時間點(diǎn)PBMCs中的p38MAPK活性表達(dá)與對照組比較顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但LR組和HS組進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論使用200 mmol/L的HS進(jìn)行液體復(fù)蘇較LR能明顯減輕嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，兩組對PBMCs中的p38MAPK活性表達(dá)無差異。

燒傷休克；高滲鹽；髓過氧化物酶；丙二醛；p38絲裂原活化蛋白激酶

適量的液體復(fù)蘇對于嚴(yán)重?zé)齻颊叩拇婊钍种匾绕涫菬齻w表面積超過50%的患者［1］。乳酸鈉林格液（lactate Ringer＇s solution，LR）由于其各種電解質(zhì)含量均接近細(xì)胞外液，在臨床上被廣泛使用。然而，有研究［2］顯示，使用LR對嚴(yán)重?zé)齻M(jìn)行復(fù)蘇治療，經(jīng)常會導(dǎo)致補(bǔ)液過度，并由此引發(fā)一系列并發(fā)癥。為此，有研究者開始單獨(dú)或者聯(lián)合膠體使用高滲鹽液（hypertonic sodium solution，HS）對燒傷進(jìn)行復(fù)蘇治療，發(fā)現(xiàn)能減少因為補(bǔ)液導(dǎo)致的并發(fā)癥［3］。腸道是嚴(yán)重?zé)齻缙谧钜资軅呐K器之一，該文通過比較200 mmol/L的HS和LR對嚴(yán)重燙傷大鼠進(jìn)行液體復(fù)蘇治療，觀察其對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)以及外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 56只SD大鼠，普通級，性別無限制，體重250～350 g。動物均購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，購置后正常飼養(yǎng)1周。

1.1.2 HS的制作 配置1 L的200 mmol/L HS需要LR 955.41 ml與10%NaCl 44.59 ml。溶液中含鈉量為200 mmol/L，氯180 mmol/L，鉀3.8 mmol/L，鈣2.9 mmol/L。

1.1.3 試劑盒 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 燙傷模型制作 所有大鼠在燙傷前2 d，均給予全麻并頸外靜脈置管（全麻藥物：戊巴比妥30 mg/kg）。燙傷時先將大鼠全麻，剃除背部毛發(fā)，暴露背部皮膚并放入98℃的熱水中浸浴12 s，以此制造出大鼠30%總體表面積（total body surface area，TBSA）Ⅲ度燙傷模型。

1.2.2 實驗分組與補(bǔ)液 所有大鼠的頸靜脈置管2 d后，隨機(jī)分為3組：對照組（8只，未予燙傷直接解剖）、LR組（24只，燙傷后給予LR補(bǔ)液）、HS組（24只，燙傷后給予HS補(bǔ)液）。補(bǔ)液參照Pruitt公式［4］進(jìn)行。

1.3 標(biāo)本收集將對照組8只大鼠于頸靜脈置管后2 d處死，LR組和HS組分別在燙傷后2、8、24h各取8只大鼠進(jìn)行解剖。收集3組大鼠腹主動脈血以及小腸組織（距離胃幽門4 cm）。于腹主動脈血中提取出血單個核細(xì)胞并置于－80℃低溫冰箱中儲存。將取出的小腸組織迅速液氮冷凍置于－80℃低溫冰箱中儲存。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 腸組織MPO活性的檢測 將冷凍的腸組織取出，在生理鹽水中按照重量體積比1∶10進(jìn)行解凍混勻，勻漿按照1∶1進(jìn)行稀釋。之后將得到的樣本按照廠家說明，使用中國上海生產(chǎn)的721分光光度計進(jìn)行檢測MPO分析盒樣本在460 nm的吸光度。根據(jù)在37℃下分解每克腸組織消耗了1 μmol的過氧化氫所需的MPO量得出一個單位的MPO活性。

1.4.2 腸組織MDA含量的檢測 使用MDA試劑盒測定腸組織MDA含量。將冷凍的腸組織置于冰浴器內(nèi)在生理鹽水中按照重量體積比1∶10進(jìn)行混勻。均漿在4℃下按照900 r/min離心10 min。嚴(yán)格按照制造商的說明測量上清液中的MDA含量并使用分光光度計測量標(biāo)本在532 nm下的吸光度。上清液中的蛋白濃度使用染色法進(jìn)行測量，MDA含量用每毫克蛋白所含MDA納米摩爾數(shù)進(jìn)行描述。

1.4.3 PBMCs的分離與p38 MAPK活性的檢測將冷凍的PBMCs取出后復(fù)蘇并用冷的細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞溶解。溶解產(chǎn)物在冰上孵育15 min，在1 400 r/min下離心15 min，收集上清液用于分析。蛋白提取物（40 μg）通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行分離，并電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。該膜在程序阻止后，先使用p38和p-p38的初級抗體（美國圣克魯斯生物工程公司）進(jìn)行免疫印跡，后在4℃的溫度下放置一夜，后加入第二抗體孵育。免疫反應(yīng)陽性的條帶用ECL免疫印跡檢測系統(tǒng)（英國安瑪西亞公司）進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，所得資料以±s表示，實驗中3組間的數(shù)據(jù)按照單因素方差法（ANOVA）進(jìn)行分析，LR組與HS組各時相點(diǎn)間比較采用t檢驗進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 200 mmol/L的HS能減低嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織的MPO活性LR組各時間點(diǎn)腸組織的MPO活性與對照組比較有顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；而對照組中腸組織MPO活性與對應(yīng)的HS組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HS組各時間點(diǎn)MPO活性與LR組比較有顯著減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。ANOVA的F值為7.833，t檢驗的2、8及24h的t值分別為7.155、2.417及2.441，見圖1。

圖1 200 mmol/L HS對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織MPO活性的影響

2.2 200 mmol/L的HS能減少嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織的MDA含量LR組各時間點(diǎn)腸組織的MDA含量與對照組比較有顯著性增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；而對照組中腸組織MPO活性與對應(yīng)的HS組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HS組各時間點(diǎn)MDA含量與LR組比較有顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。ANOVA的F值為6.025，t檢驗的2、8及24h的t值分別為2.522、2.678及3.161，見圖2。

圖2 200 mmol/L HS對嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織MDA含量的影響

2.3 200 mmol/L的HS對嚴(yán)重燙傷大鼠PBMCs中p38MAPK活性的影響燒傷后PBMCs中的p38MAPK活性明顯增強(qiáng)，LR組與HS組在相應(yīng)的3個時間點(diǎn)上與對照組相比p38MAPK活性表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.01），而對比HS組與LR組3個時間點(diǎn)上的PBMCs中p38MAPK活性含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ANOVA的F值為13.901，t檢驗的2、8及24h的t值分別為0.037、1.100及－1.239，見圖3。

圖3 200 mmol/L HS對嚴(yán)重燙傷大鼠PBMCs中p38MAPK活性的影響

3 討論

嚴(yán)重?zé)齻螅捎诖竺娣e皮膚組織的壞死以及毛細(xì)血管通透性的增加使大量體液丟失，導(dǎo)致患者較早發(fā)生休克。燒傷休克能引發(fā)組織缺氧并影響鈉ATP酶泵的功能，這使得大量的鈉離子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，降低了細(xì)胞外的晶體滲透壓，細(xì)胞水腫明顯，進(jìn)一步加重了低血容量［5］。鈉離子內(nèi)移引起的低鈉血癥將進(jìn)一步加重組織細(xì)胞水腫，甚至導(dǎo)致器官功能障礙。因此，適當(dāng)?shù)厥褂肏S有助于減輕組織細(xì)胞水腫，防止醫(yī)源性并發(fā)癥。前期的研究［4］顯示使用200 mmol/L的HS復(fù)蘇休克較LR能明顯減輕肺水腫以及阻止低鈉血癥的發(fā)生。

嚴(yán)重?zé)齻螅瑱C(jī)體迅速發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，中性粒細(xì)胞聚集，氧自由基的產(chǎn)生增加，并通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞膜的氧化損傷最終致使細(xì)胞壞死［6］。對于腸組織主要表現(xiàn)為組織缺血缺氧，黏膜屏障受損，大量的中性粒細(xì)胞被激活聚集到腸組織中，由此大量產(chǎn)生的MPO打破了氧化與抗氧化物質(zhì)平衡引起腸道損傷。國外相關(guān)研究［7］表明與LR比較，使用HS復(fù)蘇休克可降低組織中MPO的含量，提高患者的生存率。嚴(yán)重?zé)齻篌w內(nèi)氧自由基含量增加，各組織器官中的MDA的含量也明顯升高［8］。因此，腸組織均漿中MDA的濃度可以評估腸組織中氧自由基釋放所引發(fā)的細(xì)胞損傷程度。在比較LR組和HS組數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)200 mmol/L的HS能明顯降低嚴(yán)重?zé)齻蟠笫竽c組織中的MPO活性以及MDA濃度，表明使用200 mmol/L的HS復(fù)蘇能減輕腸組織缺血缺氧后的中性粒細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞損傷。最近研究［9］顯示輸注適量的HS（365 mOsm/L）較等滲鹽溶液能明顯減輕大鼠腸缺血后的缺血再灌注損傷。

PBMCs是產(chǎn)生腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等細(xì)胞因子的主要免疫細(xì)胞，在燒傷與創(chuàng)傷后早期的全身炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。p38MAPK是人體內(nèi)MAPK通道中的最重要的分支之一，激活p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是許多蛋白質(zhì)誘導(dǎo)炎癥過程以及調(diào)控細(xì)胞因子分泌的關(guān)鍵因素［10］。因此，測定PBMCs中的p38MAPK可以了解嚴(yán)重燙傷后大鼠的早期全身炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。薛麗等［11］研究發(fā)現(xiàn)，HS（719 mmol/L）對失血性休克大鼠復(fù)蘇與等滲鹽水比較，T淋巴細(xì)胞的p38MAPK表達(dá)顯著降低。通過使用200 mmol/L的HS對嚴(yán)重燙傷大鼠復(fù)蘇與LR復(fù)蘇比較，發(fā)現(xiàn)兩者PBMCs中的p38MAPK活性表達(dá)無顯著差異，這可能與所使用的HS濃度（200 mmol/L）有關(guān)。

總之，與LR比較，使用200 mmol/L的HS復(fù)蘇能有效減輕嚴(yán)重燙傷大鼠腸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其保護(hù)作用主要是通過減少中性粒細(xì)胞在腸組織的聚集和有效減緩腸組織中氧自由基的大量釋放。對于燒傷后PBMCs中的p38MAPK活性表達(dá)的影響，兩者沒有顯著差異，有待進(jìn)一步研究。

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Effect of 200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation on oxidative stress of intestinal tissue and p38MAPK expression of PBMCs in severely burned rats

Gao Zhi1，Wu Xuesheng2，Sun Yexiang1，et al
（1Dept of Burns，2Dept of Emergency Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effect of 200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation on oxidative stress of intestinal tissue and p38MAPK expression of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in severely burned rats.MethodsFifty-six SD rats were randomly divided into three groups：control group，sodium lactate Ringer＇s solution group（LR group）andhypertonic sodium solution group（HS group）.Neck vein catheterization was used on all rats，and burn resuscitation therapy was adopted in the rats of LR group and HS group.The myeloperoxidase（MPO）activity and malondialdehyde（MDA）content of intestinal tissue were measured in three groups.PBMCs were isolated and the p38MAPK expression was determined by Western blot analysis.The data drawn from the test were statistically analyzed.ResultsThe MPO activity and MDA content of intestinal tissue at each time point after resuscitation between HS group and LR group were significantlyhigher than those of the control group（P＜0.05，P＜0.01）.The MPO activity and MDA content of intestinal tissue at each time point after resuscitation in HS group were significantly lower than those of the LR group（P＜0.05，P＜0.01），which compared with the control group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.The p38MAPK expressions of PBMCs at 2，8，24h after fluid resuscitation between LR group and HS group were significantly expressed in comparison with the control group（P＜0.01）.Theyhad no obviously difference between LR group and HS group（P＞0.05）.ConclusionCompared with sodium lactate Ringer＇s solution，200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation can attenuate oxidative stress of intestinal tissue in severely burned rats，but not affect the p38MAPK expression of PBMCs in severely burned rats.

burns shock；hypertonic saline；MPO；MDA；p38MAPK

R 644；R 605.971；R 392-33

A

1000－1492（2014）04－0439－04

2014－01－05接收

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)基金（編號：KJ2008B298）；國家自然科學(xué)基金（編號：81272092）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1燒傷科、2急診外科，合肥230022

高 智，男，碩士研究生；孫業(yè)祥，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：sunyexiang＠163.com