殼聚糖復合物對近江牡蠣糖胺聚糖中鎘的脫除

郭妍妍，吳紅棉，衣美艷，范秀萍，陳萌萌，胡雪瓊

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088）

鎘是一種有害的重金屬元素[1]，可通過呼吸道和消化道進入人體，主要在腎臟[2]中積累，生物半衰期為10～35 a，生物毒性效應范圍為0.001～0.01 mg/L[3]。鎘作為一種神經(jīng)毒物[4]，可促使皮質(zhì)神經(jīng)細胞的氧化損傷和脂質(zhì)過氧化，破壞線粒體膜的通透性使其電位下降，干擾ATP合成，誘導NOS大量表達產(chǎn)生大量NO從而導致細胞凋亡[5-6]；也可與鋅蛋白酶相互作用，置換出鋅，從而降低酶的生物活性，誘發(fā)糖尿病和動脈性胃萎縮等疾病[7]。近江牡蠣糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是從近江牡蠣（Ostrea rivularisGould）中提取出的活性物質(zhì)，研究表明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等活性[8-9]，可作為開發(fā)新型藥物或功能保健食品的重要來源。但是近年來，隨著工業(yè)污水的排放，海洋環(huán)境受到嚴重污染，導致一些濾食性貝類體內(nèi)重金屬含量超標[10]，進而影響貝類的食用安全、經(jīng)濟價值及某些生理活性[11]。殼聚糖是一種天然堿性多糖，分子中的氨基和羥基對重金屬具有很好的吸附能力，并且便于對其進行改性制備殼聚糖衍生物[12-13]。研究表明殼聚糖及其衍生物可用于醫(yī)藥、食物、生活用品及工業(yè)凈水[14]。研究人員[15-17]利用殼聚糖及其衍生物對貝類中的鎘進行脫除，脫除率可達90%以上，但脫除劑的適用pH值范圍較窄、難以分離、成本高而且會造成貝類的營養(yǎng)成分損失及二次污染，因此在保證營養(yǎng)成分含量的基礎(chǔ)上對貝類中的鎘進行有效地脫除具有重要的意義。

本實驗主要是在保證糖胺聚糖含量的基礎(chǔ)上，研究凹土-殼聚糖復合物對近江牡蠣糖胺聚糖中鎘脫除的效果，首先對近江牡蠣及其糖胺聚糖粗品中鎘、鉛、砷和汞4 種有害重金屬進行測定分析，然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應面法探究糖胺聚糖中鎘脫除的最優(yōu)條件，為以后貝類中重金屬脫除的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣（去殼） 湛江東風市場；凹土-殼聚糖復合物 廣東海洋大學實驗室；肝素鈉 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；阿利新藍 上海藍季科技發(fā)展有限公司；胰酶、枯草桿酶、活性炭、硅藻土、乙醇、高氯酸、硝酸（均為分析純） 湛江市林達化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-5000原子吸收光譜儀 日本日立公司；AF610A原子熒光光譜儀 北京吉天儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；722型分光光度計上海精密科學儀器有限公司；ES-500電子天平 長沙湘平科技發(fā)展有限公司；TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Cd、Pb、As、Hg及GAG含量的測定

Cd[18]、Pb[19]的測定：采用火焰原子吸收光譜法；As[20]、Hg[21]的測定：采用原子熒光法；糖胺聚糖的測定：阿利新藍法[22]。

式中：m、M分別為脫鎘前后貝類多糖中GAG的含量/（mg/kg）。

1.3.2 牡蠣GAG中鎘脫除的流程

式中：M1、M2分別為脫鎘前后GAG粗品中鎘含量/（mg/kg）。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酶解液pH值的篩選

等量量取6 份40 mL酶解液，分別緩慢加入0.3 g凹土-殼聚糖復合物，依次調(diào)節(jié)酶解液的pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室溫條件下振蕩30 min，振蕩速率為150 r/min。然后離心，上清液醇沉制得GAG粗品，測定其中鎘含量與GAG的回收率。重復3 次。

1.3.3.2 振蕩時間的篩選

酶解液的pH值為7.0，振蕩時間分別為0、15、30、45、60、90 min，其他步驟同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 復合物添加量的篩選

酶解液的pH值為7.0，凹土-殼聚糖復合物添加量分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/mL，其他步驟同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.4 振蕩速率的篩選

酶解液的pH值為7.0，振蕩速率分別為0、50、100、150、200、250 r/min，其他步驟同1.3.3.1節(jié)。

1.3.4 響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以近江牡蠣全臟器酶解液的pH值、振蕩時間、復合物添加量和振蕩速率為對象，以鎘脫除率和GAG回收率為響應指標，利用中心組合設(shè)計方法進行編碼及響應面試驗、JMP軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，優(yōu)化牡蠣糖胺聚糖中鎘脫除的條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣全臟器、GAG粗品及其精制品中4 種有害重金屬含量測定結(jié)果

表1 牡蠣全臟器及其多糖中重金屬含量Table 1 Contents of heavy metals in entire viscera and crude and re fine GAG from Ostrea rivularis Gould mg/kg

由表1可以看出，牡蠣全臟器、糖胺聚糖粗品和精品中鎘含量最高，說明牡蠣對鎘的吸附能力最強；鎘、鉛和砷3 種有害重金屬在GAG粗品中的含量明顯高于全臟器，這是樣品濃縮的結(jié)果；而GAG精制后3 種重金屬含量又低于粗品，這是由于部分重金屬主要與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合[23]，精制除去了大部分蛋白，重金屬離子的含量也隨之下降，但是含量依然很高，表明牡蠣體內(nèi)重金屬主要以其他結(jié)合形式存在。

2.2 酶解液pH值對GAG粗品的脫鎘率和GAG回收率的影響

圖1 pH值對脫鎘率和GAG回收率的影響Fig.1 Effect of hydrolysate pH on cadmium removal rate and GAG yield

由圖1可知，鎘脫除率隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢。溶液的pH值偏酸性時，H+與金屬離子產(chǎn)生競爭性吸附，不利于鎘離子與氨根和氫氧根螯合；隨著pH值升高，H+濃度不斷降低，鎘離子的吸附率逐漸升高；pH值偏堿性時，會出現(xiàn)氫氧化鎘沉淀[24]，鎘的脫除率應該會有所提高，但堿性條件下不利于重金屬離子從牡蠣中離解[25]，因此鎘脫除率反而會下降。pH值接近中性時，GAG回收率最大，偏酸偏堿都會降低，這是由于糖胺聚糖在中性條件下比較穩(wěn)定。

2.3 振蕩時間的影響

圖2 振蕩時間對脫鎘率和GAG回收率的影響Fig.2 Effect of shaking time on cadmium removal rate and GAG yield

由圖2可知，脫鎘率隨著反應時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且在45 min處達到最大。這是由于隨著反應進行，凹土-殼聚糖不斷與鎘離子結(jié)合進行吸附脫除，在45 min時，對鎘離子的吸附基本達到飽和，隨后絡(luò)合物發(fā)生降解，鎘的吸附量降低。而GAG回收率隨振蕩時間變化而變化的程度不大，在30 min時有最大值。

2.4 凹土-殼聚糖添加量的影響

圖3 凹土-殼聚糖添加量對脫鎘率和GAG回收率的影響Fig.3 Effect of complex-to-hydrolysate ratio on cadmium removal rate and GAG yield

由圖3可知，凹土-殼聚糖添加量在2.5～7.5 mg/mL之間，糖胺聚糖中鎘的脫除率迅速提高，之后基本保持不變，說明鎘的脫除已基本飽和。GAG質(zhì)量濃度在2.5～7.5 mg/mL之間基本沒有變化，之后隨著添加量的增加逐漸降低，這是由于過多的復合物會吸附一定量的糖胺聚糖。

2.5 振蕩速率的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩速率的增大脫鎘率迅速提高，150 r/min之后，脫鎘率的提高相對緩慢。這表明振蕩速率的增大可加快分子之間的運動，使得復合物與鎘離子的接觸機會增大，從而有利于螯合和吸附作用的進行。GAG回收率隨振蕩速率的增大的變化不是很明顯，說明振蕩速率的增大對GAG回收率的影響不是很大。

圖4 振蕩速率對脫鎘率和GAG回收率的影響Fig.4 Effect of shaking speed on cadmium removal rate and GAG yield

2.6 中心組合試驗設(shè)計

表2 中心組合試驗因素水平設(shè)計表Table 2 Coded levels for the independent variables used in central composite design

表3 中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果Table 3 Central composite experiment design and results for response surface analysis

采用中心組合設(shè)計原理優(yōu)化凹土-殼聚糖對GAG中重金屬鎘的脫除條件。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇pH值（A）、振蕩時間（B）、添加量（C）和振蕩速率（D）4 個因素，設(shè)計四因素五水平的中心組合試驗，見表2，以脫鎘率（Y1）和GAG回收率（Y2）為評價指標，分別探討4 個因素對試驗結(jié)果的影響，并確定最優(yōu)條件，以探討凹土-殼聚糖對近江牡蠣GAG中鎘脫除的應用效果。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.6.1 脫鎘率的中心組合設(shè)計試驗分析

表4 響應面模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surface regression model for cadmium removal rate

由表4可知，鎘脫除率的回歸模型極顯著（P＜0.000 1＜0.01），回歸模型的方差分析失擬項不顯著（P=0.362 9＞0.05），說明模型擬合較好。模型相關(guān)系數(shù)R2=97.47%＞95%，模型具有良好的相關(guān)性。模型變異系數(shù)為3.222%，表示模型的置信度較高，即模型能夠較好的反應真實的試驗值。

表5 響應面模型中各因素的顯著性分析Table 5 Significance analysis of the terms in the regression model for cadmium removal rate

由表5響應面模型中各因素顯著性分析可以看出，單因素A對脫鎘率影響顯著，大小順序依次為：A＞＞D＞C＞B；交互項AB、AC、BC和B D之間的交互作用影響顯著，二次項A2、B2、C2、D2影響顯著，其他項作用不顯著。剔除不顯著項，得到鎘脫除率的回歸模型為：Y1=72.82＋3.93A＋2.09AB＋1.99AC－2.21BC－2.15BD－4.65A2－4.25B2－5.69C2－2.24D2。根據(jù)表5中單因素和交互項的顯著性分析，選擇影響顯著的AB、AC、BC和BD作圖觀察優(yōu)化結(jié)果條件下4 個因素對脫鎘率的變化影響。從圖5～8可以看出，等高線呈現(xiàn)橢圓型，表明各圖中所對應的交互作用均顯著；從響應面立體圖可以看出，響應值存在最大值，軟件分析計算可得鎘脫除率的最大值為73.78%，模擬方程求解可得脫除條件為：pH 7.23、振蕩時間30.48 min、添加量6.37 mg/mL、振蕩速率170.46 r/min。

圖5 pH值和時間交互作用影響脫鎘率的曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysate pH and shaking time on cadmium removal rate

圖6 pH值和添加量交互作用影響脫鎘率的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysate pH and complex-to-hydrolysate ratios on cadmium removal rate

圖7 時間和添加量交互作用影響脫鎘率的曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of shaking time and complex-to-hydrolysate ratio on cadmium removal rate

圖8 時間和振蕩速率交互作用影響脫鎘率的曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot of the effect of shaking time and speed on cadmium removal rate

2.6.2 GAG回收率的中心組合設(shè)計試驗分析

表6 響應面模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface regression model for GAG yield

由表6對響應面二次模型進行的方差分析知，GAG回收率的回歸模型極顯著，回歸模型的方差分析失擬項不顯著，說明模型擬合較好。模型相關(guān)系數(shù)R2=96.02%＞95%，模型具有良好的相關(guān)性。模型變異系數(shù)為4.254%，表示模型的置信度較高，模型能夠較好的反映真實值。

表7 響應面模型中各因素的顯著性分析Table 7 Significance analysis of the terms in the regression model for GAG yield

由表7響應面二次模型中各因素顯著性分析可以看出，單因素A和D對GAG回收率影響顯著，大小順序依次為：A＞D＞＞C＞B；交互項AC、BC、BD和CD之間的交互作用影響顯著，二次項A2、B2、C2、D2影響顯著，其他項作用不顯著。剔除不顯著項GAG回收率的響應面回歸模型是：Y2=43.93＋1.08A－0.80D－1.78AC－1.43BC－2.59BD－2.14CD－1.70A2－3.17B2－3.46C2－1.13D2。根據(jù)表7中單因素和交互項的顯著性分析，選擇影響顯著的AC、BC、BD和CD作圖觀察優(yōu)化結(jié)果條件下4個因素對GAG回收率的變化影響。從圖9～12可以看出，等高線明顯呈現(xiàn)橢圓型，表明各圖中所對應的交互作用均很顯著；從響應面立體圖可以看出，響應值存在最大值，軟件分析計算可得GAG回收率的最大值為45.21%，模擬方程求解可得脫除條件為pH 7.64、振蕩時間36.39 min、添加量7.15 mg/mL和振蕩速率100.00 r/min。

圖9 pH值和添加量交互作用影響GAG回收率的曲面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysate pH and complex-to-hydrolysate ratio on GAG yield

圖10 時間和添加量交互作用影響GAG回收率的曲面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of shaking time and complex-to-hydrolysate ratio on GAG yield

圖11 時間和振蕩速率交互作用影響GAG回收率的曲面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots of the effect of shaking time and speed on GAG yield

圖12 添加量和振蕩速率交互作用影響GAG回收率的曲面圖和等高線圖Fig.12 Response surface and contour plots for the effect of complex-tohydrolysate ratio and shaking speed on GAG yield

本實驗研究要綜合考慮鎘脫除效果及GAG的結(jié)構(gòu)與含量的穩(wěn)定性，而牡蠣酶解液中鎘含量為3.8 mg/mL，綜合考慮選擇脫鎘率最大時的優(yōu)化條件，即：pH 7.23、振蕩時間30.48 min、添加量6.37 mg/mL、振蕩速率170.46 r/min，此時脫鎘率為73.78%，GAG回收率為44.24%，此條件下的GAG理論值與最大值45.21%差別不大，所以最終確定的最優(yōu)鎘脫除條件為pH 7.2，振蕩時間30 min、添加量6.4 mg/mL和振蕩速率170 r/min。按照所得最優(yōu)條件進行驗證實驗，脫鎘率為73.7%，GAG回收率為44.1%，與理論預測值基本相符，說明模型所得的優(yōu)化條件合理有效，此時牡蠣GAG中鎘的含量為0.999 mg/kg，并且對GAG回收率幾乎無影響。

3 結(jié) 論

凹土-殼聚糖復合物對牡蠣GAG粗品中脫除鎘的最優(yōu)條件為：pH 7.2、振蕩時間30 min、添加量6.4 mg/mL、振蕩速率170 r/min，在此條件下的脫鎘率為73.7%，GAG回收率為44.1%。

實驗表明利用凹土-殼聚糖復合物對牡蠣GAG中的鎘進行脫除，可有效地降低鎘的含量，操作簡單，條件溫和，不會產(chǎn)生二次污染，并且對GAG的回收率影響不大。

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