馬鈴薯皮中綠原酸提取工藝優化

李次力，劉 暢，劉天怡，金瑱琪，侯 靜

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

馬鈴薯，別名土豆、洋芋，植物馬鈴薯是茄科茄屬一年生草本。其塊莖可供食用，是重要的糧食、蔬菜兼用作物，是世界四大糧食作物之一[1]。馬鈴薯具有豐富的營養，一般新鮮馬鈴薯中所含成分：淀粉9%～20%，脂肪0.1%～1.1%，粗纖維0.6%～0.8%。100 g馬鈴薯中所含的營養成分：熱量66～113 J，鈣11～60 mg，磷15～68 mg，鐵0.4～4.8 mg，硫胺素0.03～0.07 mg，核黃素0.03～0.11 mg，尼克酸0.4～1.1 mg等。除此以外，馬鈴薯塊莖還含有禾谷類糧食所沒有的胡蘿卜素和抗壞血酸[2-4]。

馬鈴薯鮮薯可供燒煮作為糧食或蔬菜。世界各國生產的馬鈴薯加工食品，如法式凍炸條、炸片、速溶全粉以及花樣繁多的糕點、蛋卷等，為數達100多種[5-6]。對于加工馬鈴薯后的皮，作為廢物丟棄。而馬鈴薯可作為抗衰老食物，是由于其中所含的酚類物質具有保健作用[7-8]。馬鈴薯塊莖中總酚含量以干質量計在0.11%～0.13%之間，芽中含量高達0.18%，其中約90%是綠原酸[9]。酚類物質主要存在于馬鈴薯的皮和皮層之間，約有50%存在于皮及鄰近的組織中，越靠近塊莖的中心，濃度越低[10-11]。

綠原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeic acid）與奎尼酸（quhaoacid）組成的縮酚酸，異名咖啡靴酸，化學名3-O-咖啡酞奎尼酸（3-O-caffeoylquinic acid），是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物[12]。綠原酸是食品、藥品、化妝品等工業的重要原料。綠原酸具有廣泛的生物活性，對自由基的清除和抗脂質過氧化作用顯著，具有抗菌、抗病毒、抗誘變、保肝、利膽等多種藥用功能[13-14]。

本實驗嘗試將對馬鈴薯鮮薯皮提取綠原酸并研究其功能性質，以期為充分利用我國馬鈴薯的資源優勢、加快馬鈴薯及其副產物的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯皮 麥肯食品（哈爾濱）有限公司。

無水乙醇、H2O2、抗壞血酸、KClO3均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALC-3100.2型電子天平 上海奕宇電子科技有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FW177型粉碎機 南京萊步科技鄭州有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 蘇州江東精密儀器有限公司；752型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；LC-20AB島津高效液相色譜儀 杭州瑞析科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將馬鈴薯皮洗凈，放入電熱鼓風干燥箱中80 ℃干燥，取出后用粉碎機粉碎成粉末，過40 目篩放入瓶中密封備用。

1.3.2 綠原酸的測定

1.3.2.1 標準曲線的測定

用天平準確稱取綠原酸標準品0.005 g，用70%乙醇溶液溶解定容于100 mL的質量濃度為0.05 mg/mL標準液，搖勻，備用。

分別準確量取上述0.05 mg/mL的標準液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容至10 mL，以空白試劑為對照，327 nm波長處測定吸光度，以綠原酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖[15]。綠原酸得率按式（1）計算：

式中：Y為綠原酸得率/（mg/g）；m1為綠原酸的質量/mg；m0為原料馬鈴薯皮粉的質量/g。

1.3.2.2 馬鈴薯皮中綠原酸的提取方法

采用乙醇回流提取法，提取方法如下：將索氏提取器的各部位充分洗滌并用蒸餾水清洗后烘干，然后將含有樣品的濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內，連接已干燥至恒質量的脂肪燒瓶，由提取器冷凝管上端加入乙醇至瓶內容積的2/3處，通入冷凝水，將底瓶浸沒在水浴中加熱，用一小團脫脂棉輕輕塞入冷凝管上口。抽提完畢，回收乙醇，然后稱質量[16-17]。

1.3.3 乙醇回流法提取綠原酸的條件優化

1.3.3.1 料液比的選擇

取12 g馬鈴薯皮干粉放入濾紙筒內，然后分別取馬鈴薯皮干粉與乙醇之間的料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g/mL）進行乙醇回流提取實驗，75%乙醇溶液，95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，進行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后以75%的乙醇溶液作為空白對照，放入紫外分光光度計中進行綠原酸含量測定。

1.3.3.2 乙醇體積分數的選擇

分別配制70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液，取12 g馬鈴薯皮干粉，料液比1∶12、95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，進行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后分別以75%、80%、85%、90%的乙醇溶液作為空白對照，放入紫外分光光度計中進行綠原酸含量的測定。

1.3.3.3 提取溫度的選擇

分別設定91、93、95、97、99 ℃的提取溫度，取12 g馬鈴薯皮干粉，料液比1∶12、80%乙醇溶液，回流3 次提取完成后，進行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，以85%乙醇溶液作為空白對照，放入紫外分光光度計中進行綠原酸含量的測定。

1.3.3.4 回流次數的選擇

取12 g馬鈴薯皮干粉放入濾紙筒內，料液比為1∶12、80%乙醇溶液、95 ℃水浴，分別回流1、2、3、4、5 次進行乙醇回流提取實驗，提取完成后，進行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后以85%的乙醇溶液作為空白對照，放入紫外分光光度計中進行綠原酸含量的測定。

1.3.4 綠原酸提取正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選定因素水平，以料液比A、乙醇體積分數B、提取溫度C、回流次數D為因素，設計四因素三水平L9（34），進行正交試驗，優化組合。所選水平如表1所示。

表1 馬鈴薯皮中提取綠原酸正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design for the extraction of chlorogenic acid from potato peel

1.3.5 高效液相色譜法鑒定綠原酸[18-19]

分析條件：L a b C18分析柱：（2 5 0 m m×4.5 m m），流動相為乙腈∶檸檬酸緩沖溶液∶水（10∶20∶70，V/V），流速為1.0 mL/min，室溫，進樣量為20 μL，檢測波長為324 nm。

利用高效液相色譜在相同色譜條件下，將標準溶液色譜圖與樣品色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中的綠原酸。

1.3.6 綠原酸的抗氧化性分析

1.3.6.1 綠原酸對DPPH自由基的清除作用

配制濃度為20 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液保存于棕色瓶中（臨用前現配）。向比色管中加入2.0 mL DPPH自由基乙醇溶液，2.0 mL不同質量濃度馬鈴薯綠原酸提取物，搖勻，室溫條件下避光靜置30 min，然后在517 nm波長處測定吸光度A1；用等體積乙醇代替樣品，測定吸光度A0；以VC作為陽性對照品，以樣品質量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，制作樣品質量濃度與DPPH自由基清除率關系曲線[20-21]。按照式（2）計算清除率：

1.3.6.2 綠原酸對羥自由基的清除作用

將8 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，6 mmol/L的H2O2溶液0.8 mL，蒸餾水0.5 mL，不同質量濃度的馬鈴薯綠原酸提取物1.0 mL，20 mmol/L水楊酸鈉溶液0.2 mL混合，搖勻，置于37 ℃水浴中1 h，然后于562 nm波長處測定混合物吸光度A1；用等體積的蒸餾水代替樣品溶液，其余不變，測定吸光度A0；以VC為陽性對照，相同方法進行測定[22-23]。按照式（3）計算馬鈴薯綠原酸提取物及VC對羥自由基的清除率：

2 結果與分析

2.1 綠原酸標準曲線的繪制

按標準曲線制作方法，得出綠原酸標準曲線，回歸方程為y=67.4x＋0.001 4（相關系數R2=0.999 6），可見，綠原酸在0.001～0.005 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.2 提取綠原酸的單因素試驗

2.2.1 料液比對綠原酸得率的影響

圖1 料液比對綠原酸得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖1可以看出，綠原酸得率隨提取液用量的增加而增大，當料液比為1∶12時，提取效果最佳，再增大提取液用量時，綠原酸的得率增長趨勢平緩，說明馬鈴薯皮組織內的絕大部分綠原酸已浸出。有機溶劑與水的混合液可打斷馬鈴薯酚類物質與蛋白質、多糖等物質的結合鍵，有利于其酚類物質的浸提。所以隨著提取液用量的增加馬鈴薯酚類物質浸提率也增加；但當提取液用量增加到一定比例時，浸提率將趨于穩定[24]。從生產成本和提取效果兩方面綜合考慮，適宜的料液比為1∶12。

2.2.2 乙醇體積分數對綠原酸得率的影響

圖2 乙醇體積分數對綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖2可以看出，綠原酸得率隨著乙醇體積分數的增大而升高，在乙醇體積分80%時，提取效果最佳，但當大于80%時，得率下降。隨著浸提時間的延長，馬鈴薯皮與溶劑充分接觸，因而綠原酸得率隨乙醇體積分數的增大而增大，但是當乙醇體積分數過大時，由于乙醇本身的特性，馬鈴薯皮組織內的一些綠原酸不易被高體積分數的乙醇提取，所以使得綠原酸的得率反而有所降低。所以提取綠原酸最適宜的乙醇體積分數為80%。

2.2.3 提取溫度對綠原酸得率的影響

圖3 提取溫度對綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖3可以看出，綠原酸得率隨著提取溫度的升高而升高，但是當達到95 ℃左右后又開始下降。綠原酸易溶于水，但當溫度降低時，溶解性變差，所以溫度太低不利綠原酸的溶出，隨著溫度的升高，分子運動速率加快，馬鈴薯皮與乙醇的傳質作用加強[25]，但綠原酸不穩定，當溫度過高時，會加速綠原酸的分解，并使其有效成分被破壞，綠原酸失活，使綠原酸的得率降低[26]。所以最適宜的提取溫度為95 ℃。

2.2.4 回流次數對綠原酸得率的影響

由圖4可以看出，綠原酸得率隨著回流次數的增加而增大，當回流次數大于3 次時，綠原酸的得率變化不大，這可能是因為回流次數過少，馬鈴薯皮中的綠原酸未能充分溶出，隨著回流次數的增加，綠原酸逐漸溶解到溶劑中，考慮到回流次數過多，溶劑的消耗量增大，所以最適宜的提取回流次數為3 次。

圖4 回流次數對綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of number of repeated extractions on the extraction yield of chlorogenic acid

2.3 正交試驗優化綠原酸提取的最佳條件

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2、3可得，各因素對綠原酸得率的影響程度依次為C＞D＞B＞A，其中C為主要因素，D、B、A為次要因素，綜上所述，A1B3C3D2為最佳提取工藝條件，即料液比1∶10、乙醇體積分數85%、提取溫度97 ℃、回流3 次時，綠原酸得率最高，提取物經冷凍干燥得馬鈴薯皮綠原酸提取物粉末[17]。

2.4 驗證實驗

按正交試驗確定的最佳提取工藝條件進行驗證實驗，綠原酸得率為2.229 mg/g，表明此正交試驗得出的最優組是符合實際的。

2.5 高效液相色譜法鑒定綠原酸

對馬鈴薯皮提取液中是否含有綠原酸進行定性分析，標準樣品的色譜圖如圖5所示，樣品則選取了70%乙醇提取液進行譜圖繪制，見圖6。根據圖5、6表明檢測物均在10.211 min處出現最大吸收峰，可以初步斷定兩種物質為同一化合物。

圖5 高效液相色譜綠原酸標準溶液色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid solution

圖6 70%乙醇馬鈴薯皮提取液色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of 70% ethanol extract from potato peel

2.6 綠原酸的抗氧化性

2.6.1 馬鈴薯綠原酸對DPPH自由基的清除作用

圖7 綠原酸及VC對DPPH自由基清除的作用Fig.7 DPPH radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

如圖7所示，在實驗質量濃度范圍內，VC、綠原酸對DPPH自由基的清除作用隨質量濃度升高逐漸增強，達到0.06 mg/mL后，清除率上升緩慢，質量濃度為0.2 mg/mL時，樣品對DPPH自由基清除率最大，達到85.13%，VC達到90.12%。由此可以看出，綠原酸對DPPH自由基的清除作用與VC對其的清除作用相差不大，表明綠原酸具有較強的抗氧化能力。

2.6.2 綠原酸對羥自由基的清除作用

圖8 綠原酸及VC對羥自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

圖8結果表明，在實驗質量濃度范圍內（0.02～0.5 mg/mL），綠原酸與VC對羥自由基表現出一定的抑制作用，并隨著質量濃度的增加，清除率增大，當綠原酸質量濃度達到0.3 mg/mL后，清除率增加緩慢，當質量濃度為0.5 mg/mL時，綠原酸對羥自由基的清除率達到最大，為43.14%，VC對羥自由基的清除率為55.26%，表明綠原酸對羥自由基有一定的清除作用。

3 結 論

本實驗以馬鈴薯皮為原料，應用乙醇回流法提取其中的抗氧化物質綠原酸，采用單因素和正交試驗來確定提取綠原酸得率的最佳工藝條件，并且將其應用到油脂中測其抗氧化效果。得到以下結論：1）料液比1∶10、乙醇體積分數85%、提取溫度97℃、回流3次時馬鈴薯皮中綠原酸得率最高，即提取綠原酸的最優組合條件為A1B3C3D2。其中，對于綠原酸得率影響最大的因素是提取溫度。2）綠原酸對于DPPH自由基、羥自由基有一定的清除作用，從而可以得知，本實驗從馬鈴薯皮中提取的綠原酸具有一定的抗氧化性，證實了馬鈴薯皮中的確含有抗氧化物值得利用生產。

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