蒜氨酸標準物質的定值研究

張海波，李新霞,，孟 磊，趙東升,2，陳 堅,3

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆比爾兄弟生物技術有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆埃樂欣藥業有限公司，新疆 烏魯木齊 830011）

大蒜為百合科蔥屬植物蒜（Allium sativumL.）的地下鱗莖，文字記載大蒜藥食兩用已經有數千年歷史[1]。在古埃及、印度、歐洲等地的許多國家和地區，藥用大蒜的歷史長遠而經久不衰，并且還在不斷擴大[2-3]。1985年前后發現大蒜除抗感染作用之外，還具有防治心腦血管疾病及抗腫瘤等功效，大蒜成為世界發達國家研究的熱點[4]。目前國內外公認的大蒜活性成分為含硫氨基酸——蒜氨酸在蒜酶催化下產生的大蒜辣素及一系列分解產物[5]。

由于大蒜的功效作用，作為保健品和藥品，大蒜及其制劑在國內外非常暢銷，美國藥典、歐洲藥典及中國藥典均收載了大蒜及相關品種的質量標準[6-8]，其中有的以蒜氨酸為質控指標之一，其化學結構式見圖1。國內外有關蒜氨酸分離純化研究的報道較少，但隨著大蒜功效作用研究及制劑開發取得一定進展，國內外對蒜氨酸研究越來越熱。美國已有藥典對照品出售，但價格昂貴，測試成本太高，且國內購買不便；在國內雖有一些公司已經自制了較高純度的蒜氨酸，但均未得到國家標準委的認證，不是法定對照品，質量良莠不齊，同樣也無法滿足新藥申報的要求。為了確保測試結果的可靠性、可比性和溯源性，規范大蒜及相關產品的檢測與質量控制、檢測方法評定，蒜氨酸標準物質的研制尤為重要。前期，新疆埃樂欣藥業有限公司聯合新疆醫科大學直接從新疆優質大蒜中提取純化天然蒜氨酸作為標準樣品，完成了蒜氨酸的提取、分離、純化和結構鑒定[9]，并申請了3 項發明專利[10-12]，填補了國內空白，本實驗將進一步對其進行定值研究。

圖1 蒜氨酸的化學結構式Fig.1 Chemical structure of alliin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；三氟乙酸（分析純） 中國吳江桃源試劑廠；去離子水由超純水機制取。

1.2 儀器與設備

e2695高效液相色譜儀（配有2489紫外檢測器和Empower3液相工作站） 美國Waters公司；Milli-Q超低有機物超純水機 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

鮮蒜經滅酶、打漿，有機溶劑萃取，離心過濾，萃取液濃縮，通過離子交換柱層析，洗脫液濃縮，冷凍干燥得到50%的蒜氨酸粗產品。50%蒜氨酸經乙醇重結晶得到90%的蒜氨酸。以90%的蒜氨酸為原料，經丙酮與乙醇兩個溶劑系統進行重結晶和純化，獲得蒜氨酸標準樣品。紅外、紫外、核磁、質譜和旋光度結果證明分離制備所得單體為蒜氨酸，初步分析純度達99%以上。將上述制得蒜氨酸標準樣品在潔凈臺經研磨混勻后，用棕色瓶進行分裝，按照25 mg/瓶進行分裝，編號后置于冰箱0～4 ℃密封貯藏，以備進一步按照標準物質研制的技術規范對其進行均勻性檢測、穩定性檢測及定值研究[13-18]。

1.3.2 實驗條件

1.3.2.1 蒜氨酸標準樣品溶液的制備

將蒜氨酸標準樣品置于真空干燥箱中，真空度－0.8 bar、干燥溫度60 ℃、減壓干燥4 h。精密稱取蒜氨酸標準品約10.00 mg于5 mL容量瓶中，流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得高質量濃度蒜氨酸標準樣品溶液；流動相稀釋得低質量濃度蒜氨酸標準樣品溶液。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02%三氟乙酸（5∶95，V/V）；檢測波長：214 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35℃。此條件已經過系統的方法學驗證[9]。

1.3.3 樣品均勻性檢驗

隨機抽取10 瓶樣品，對樣品中蒜氨酸進行均勻性檢驗，每瓶樣品各抽取3 份子樣，每個子樣分別按照1.3.2.1節方法進行樣品前處理，并用高效液相色譜法進行分析，記錄色譜圖。對所得的數據進行單因素方差分析，以此評估樣品的均勻性。

1.3.4 樣品穩定性檢驗

考察蒜氨酸標準物質在4 ℃貯存條件下的長期穩定性，歷時43 個月，穩定性檢驗的具體實驗是在每個穩定性檢驗時間點（0、1、3、6、9、12、43 個月）從庫存樣品中隨機抽取3 瓶樣品，每瓶樣品平行分析2 次，并以3 瓶樣品的總平均值為該時間點特性值穩定性檢驗結果。對所得的數據進行t檢驗，以此評估樣品的穩定性。

1.3.5 標準樣品定值

選擇9 家有能力的實驗室進行樣品比對，分別用LAB 01～LAB 09編號表示。9 家實驗室通過實驗室間協作定值計劃，隨機抽取樣品，每個定值實驗室送2 瓶。蒜氨酸標準樣品協作測定研究要求各實驗室按照作業指導書要求開展協作定值分析工作。嚴格按照企業所附方法進行樣品的儲存、處理、測定，應用高效液相色譜面積歸一法進行定值，出具測試報告。對各定值實驗室報告的協作測定數據進行統計分析，定值結果由標準值和不確定度表示。

2 結果與分析

2.1 純度的定值方法

圖2 蒜氨酸標準物質的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatogram of alliin Certified reference material

前期以美國蒜氨酸標準對照品計算此蒜氨酸標準物質純度為99.00%[9]，滿足選擇高效液相色譜面積歸一化法進行有機化合物純度定值的條件；并且經二極管陣列檢測器200～400 nm掃描，主要雜質光譜與蒜氨酸光譜一致，即雜質與主成分響應接近，因此應用高效液相色譜面積歸一法確定蒜氨酸標準物質的純度是合理可行的[19-20]，即主峰面積占色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積的百分率。按1.3.2.1節方法配制蒜氨酸標準樣品溶液，進樣分析，記錄色譜圖（圖2）。高質量濃度時，蒜氨酸峰為平頭峰，對應的峰面積可由低質量濃度時對應的峰面積根據質量濃度倍率關系求出，此時雜質峰面積較大，測量誤差較小。

2.2 均勻性檢驗結果

表1 蒜氨酸樣品的均勻性檢測數據Table 1 Results of homogeneity testing for alliin %

采用F檢驗對蒜氨酸標準品均勻性檢驗實驗數據（表1）進行處理，得組間均方：MS間=0.037；組內均方：MS內=0.001。所以，方法重復性標準偏差：瓶間均勻性標準偏差：（每瓶測定次數均為3 次，n0=3）；不均勻性不確定度：0.08。蒜氨酸標準樣品通過比較瓶間均勻性不確定度（ubb）和均勻性檢驗分析方法重復性標準偏差（sr）的大小對抽檢特性的均勻性進行評估。ubb與sr相近，可認為被抽檢特性均勻。

2.3 穩定性檢驗結果

表2 蒜氨酸穩定性實驗結果Table 2 Long-term storage stability of alliin

由表2可知，蒜氨酸含量在檢驗期內未見明顯的變化趨勢；根據紅外、紫外、核磁、質譜、旋光度和元素分析數據并與文獻值[9]比對，均符合文獻值，表明實驗期間蒜氨酸標準物質保持穩定并未發生改變。對穩定性檢驗獲得的實驗數據，在觀察沒有明顯穩定性變化趨勢存在時，可采用一元線性擬合方程模型為穩定性研究基本模型。在一元線性回歸方程中，如果斜率的估計值（b1）等于零，即說明時間（X）與標準樣品的特性值（Y）之間不存在線性關系。這可以通過統計方法（t檢驗法）對X與Y之間是否存在線性關系進行檢驗。得斜率的估計值：截距的估計值：斜率標準偏差的估計值：t計算值：t檢驗臨界值：t臨界=2.447。通過比較t計算值（tcal）與t檢驗臨界值（t臨界）的大小評估抽樣特性的穩定性，tcal小于t臨界，可認為蒜氨酸標準樣品中蒜氨酸的測定值與檢驗時間形成的直線斜率不顯著，因而抽檢特性在檢驗期間是穩定的。

有效期t=43 個月的長期穩定性的不確定度貢獻為：

2.4 定值結果

各實驗室報告的協作定值分析結果報告中，用格拉布斯準則從統計上剔除可疑值，再用科克倫準則檢查各組數據之間是否等精度，確定所有結果均可接受，本研究原則上將不剔除任何一個結果，而是全部參與統計計算。對所有有效數據，分別計算協作測定的總均值（）、總均值標準偏差（s）和總均值相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）、測定不確定度（uchar）和相對測定不確定度（相對uchar）。蒜氨酸標準樣品協作測定研究計算結果匯總于表3。

表3 蒜氨酸的定值結果Table 3 Certified values of alliin

用t分布法估計總體均數，9 5%置信區間為99.49±0.21；測定不確定度分量uchar=0.092 8，同蒜氨酸單體樣品的均勻性檢驗中求得的瓶間均勻性不確定度ubb=0.080 0，及蒜氨酸單體樣品的穩定性檢驗中求得的長期穩定性不確定度ults=0.946，一并代入量值評定基本模型得特性值的合成不確定度uc=0.95%；按評定特性值為（99.49±0.95）%。

3 結 論

本研究制備的蒜氨酸標準樣品，通過了均勻性及穩定性檢驗，均勻性良好，且穩定期不少于43 個月。9 家實驗室協作定值后，蒜氨酸特性值為（99.49±0.95）%。現已上報國家標準委，通過審評并獲得蒜氨酸國家標準樣品證書（GSB 11-3079—2013），這對規范大蒜及相關產品的檢測與質量控制、檢測方法評定具有重要意義，可以保證分析測試質量，且測試結果具有可溯源性、準確性與合法性。

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