液態乳中氯丙二醇脂肪酸酯的檢測與污染水平初步調查

崔 霞，丁 顥，鄒建宏，李 珊，苗 虹,，傅武勝，趙云峰，吳永寧

（1.國家食品安全風險評估中心 衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021；2.第二炮兵總醫院，北京 100088；3.福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建 福州 350001）

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）是近年來發現的一類新型食品污染物，其在食用油和含油脂食品中的污染水平較高[1-4]。其中最典型、污染水平最高的是3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）酯[5]。3-MCPD酯在生物體內脂肪酶的作用下分解成3-MCPD[6]。鑒于3-MCPD是氯丙醇類污染物中最重要的代表性物質，具有生殖、腎臟和神經毒性以及潛在的致癌作用和致突變作用[7-10]，因此，由氯丙醇脂肪酸酯引發的健康風險也越來越受到人們的關注[8-9]。2007年，德國風險評估機構對氯丙醇酯的風險評估結果引起了歐盟食品安全局和聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會的重視。歐盟食品安全局食物鏈污染物專家組評估和確認了德國的3-MCPD酯數據，并進一步開展3-MCPD酯健康影響的風險評估。2008年聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會將3-MCPD酯列為優先評價的化合物。由于2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸（2-monochloropropane-1,3-diol，2-MCPD）的結構與3-MCPD極其相似，其毒性以及其可能引起的健康風險不容忽視，2-MCPD酯在食品中的污染也應該引起關注，因此，有必要對食品中的3-MCPD酯和2-MCPD酯進行同時測定。

目前，食品中氯丙醇酯檢測多采用氣相色譜質譜-（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法及液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法，其他檢測技術幾乎未見報道。檢測的食品基質以食用油脂最常見。LC-MS法直接測定氯丙醇酯本身，樣品前處理過程相對簡單[11-12]，因此，LC-MS法只能局限于測定某個或某些氯丙醇酯，而不能測定氯丙醇酯總量，因此不適合用于膳食暴露研究。GC-MS測定是將樣品中的與各種脂肪酸酸結合的氯丙醇酯轉化為氯丙醇進行測定，以氯丙醇的含量表征氯丙醇酯的含量。基本過程為脂肪水解、凈化、衍生和GC-MS測定。在脂肪水解方面，現多采用堿水解法[13-16]，以七氟丁酰化試劑[17]和苯基硼酸（phenyl boric acid，PBA）[13,16]或丁基硼酸[14,18]為最常用的衍生化試劑。本研究在前期食用油脂檢測的基礎上，以液態乳為研究對象，對樣品前處理技術進行優化，建立了同時測定液態乳中3-MCPD酯和2-MCPD酯的檢測方法，并對30 份牛乳樣品進行檢測，結合我國居民人均牛乳消費量對牛乳中氯丙醇酯引起的健康風險進行評估，以期為保障人體健康提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品購自北京市的大型超市，共30 份。

3-MCPD標準品（純度98%） 德國Aldrich公司；D5-3-MCPD（純度99%） 德國Dr Ehrenstorfer公司；2-MCPD、D5-2-MCPD、3-MCPD棕櫚酸酯和D5-3-MCPD棕櫚酸酯（純度均≥98%） 加拿大TRC公司；正己烷、乙酸乙酯（色譜純） 美國J.T.Baker公司；冰乙酸（色譜純） 美國Tedia公司；甲基叔丁基醚（分析純）天津市光復精細化工研究所；七氟丁酰咪唑（hepta fl uoro butyrylimidazole，HFBI）（分析純） 美國Pierce公司；甲醇鈉（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；氯化鈉（分析純） 北京化工廠；無水硫酸鈉（優級純，經200 ℃烘烤8 h后使用） 天津市津科精細化工研究所；超純水，電阻率為18.2 MΩ?cm，由美國Millipore公司超純水器制備。

標準溶液配制：精確稱取各標準品10 mg（精確至0.01 mg）置于10 mL 棕色容量瓶中，以乙酸乙酯為溶劑定容至刻度，分別制備質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，于－20 ℃冰箱保存。將標準儲備液用正己烷稀釋并定容，配制成10.0 mg/L的標準使用液。

1.2 儀器與設備

5975C型氣相色譜儀、7890型質譜聯用儀、HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、ChemElutTM硅藻土小柱（4 g，10 mL） 美國Agilent公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；G-560E渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；NDO-400型電熱恒溫鼓風干燥箱 杭州匯爾儀器設備有限公司；N-EVAPTM 111型吹氮濃縮儀 美國Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品水解與凈化

準確稱取2.0 g液態乳樣品，加入10 mg/L的D5-3-MCPD棕櫚酸酯內標使用液60 μL（相當于0.2 μg D5-3-MCPD），加入2 mL正己烷，并充分混勻。超聲萃取20 min，9 000 r/min 離心5min，收集正己烷相，重復提取3 次，合并提取液。加入質量濃度為10 mg/L 的D5-2-MCPD內標使用液20 μL，氮吹濃縮至約500 μL。加入500 μL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯（8∶2，V/V）和1 mL甲醇鈉-甲醇溶液（0.25 mol/L），充分振蕩，反應4 min時加入100 μL 冰乙酸，混勻，再加入3 mL 20%的氯化鈉溶液和3 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，棄去上層溶液。以3 mL 正己烷重復萃取一次，將下層水相溶液倒入ChemElutTM硅藻土小柱中，靜置10 min，加入15 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液氮吹至近干，用2 mL正己烷溶解殘渣。

1.3.2 樣品衍生

用氣密針加入HFBI 40 μL，立即密塞，渦旋混合30 s，于70 ℃恒溫箱中衍生20 min后，取出冷卻至室溫，加入20%的氯化鈉溶液2 mL，渦旋混合30 s，轉移上層有機相并加入0.3 g無水硫酸鈉除水分后，經0.22 μm有機濾膜過濾于進樣小瓶中，供GC-MS測定。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：H P-5 M S毛細管柱（3 0 m×0.25 mm， 0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃保持1 min，以2 ℃/min的速率升至90 ℃，以40 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min；載氣：高純氦；流速1.0 mL/min；進樣體積：1 μL；不分流進樣。

1.3.4 質譜條件

離子化方式為電子電離，能量70 eV；電子倍增器電壓1 000 V；選擇反應離子監測；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間8 min。主要質譜參數見表1。

表1 目標化合物GC-MS保留時間及主要質譜參數Table 1 Main MS parameters and GC-MS retention time of target compounds

2 結果與分析

2.1 檢測方法的確定

對于食品中氯丙醇酯的檢測主要包括直接測定與間接測定兩種方法。其中，直接測定法是直接測定一種或幾種不同的氯丙醇酯[19-21]，多以LC-MS法測定，作為進行暴露風險評估采用的方法，其缺陷為測定的是部分或大部分氯丙醇酯的含量，而不是總量，因此不能準確表征食品中氯丙醇酯的真實污染狀況；間接測定法是通過酯鍵斷裂反應使氯丙醇酯轉化為氯丙醇進行測定，以氯丙醇的含量計氯丙醇酯的總量[2,20]，其優點是可測定總氯丙醇酯的含量。本研究采用間接測定法，首先用正己烷將液態乳中的氯丙醇酯提取出來，以甲醇鈉進行酯鍵斷裂反應使氯丙醇從氯丙醇酯中游離出來，進行衍生化后以GC-MS測定，得到氯丙醇酯的總量。

2.2 提取方法的選擇

氯丙醇酯是脂溶性物質，在植物油樣品中可直接用甲醇鈉進行酯鍵斷裂反應使氯丙醇游離出來后衍生測定[14]。但液態乳樣品由于水分以及蛋白質含量較高，基質更為復雜，需要先將氯丙醇酯提取出來，再進行后續處理。本研究分別采用加速溶劑萃取和以正己烷進行的液-液萃取兩種方式進行了提取條件的摸索，空白加標回收實驗表明，兩種提取方法的差異不明顯。鑒于加速溶劑萃取操作復雜繁瑣，溶劑耗費量相對較大，最終確定采用以正己烷液-液萃取的方式進行提取。

2.3 酯鍵斷裂反應參數的確定

已有文獻[16-17]報道了植物油中氯丙醇酯檢測過程中酯鍵斷裂反應條件，但液態乳樣品較植物油樣品基質更為復雜，為避免由于樣品差異對酯鍵斷裂效果造成影響而導致檢測結果出現偏差，本研究以牛乳樣品為液態乳的代表性基質，對酯鍵斷裂反應的參數進行了優化。目前測定氯丙醇酯多采用甲醇鈉或硫酸甲醇溶液進行酯鍵斷裂反應[16-17]。本實驗中，使用甲醇鈉進行酯鍵斷裂反應，當配制濃度為0.5 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液時，有部分甲醇鈉析出，并懸浮于溶液中，這樣會導致每份樣品提取液中的甲醇鈉的量不一致，從而引起實驗結果偏差。因此本研究將甲醇鈉的濃度調整為0.25 mol/L，通過優化確定加入量為1.0 mL，保證了測定結果穩定可靠。

在酯鍵斷裂時間方面，德國脂肪科學（deutsche gesellschaft für fettwissenschaft，DGF）方法的水解時間為10 min[14]，有研究報道認為應控制在1 min左右，因酯鍵斷裂時間延長會引起氯丙醇降解[16]。本研究分別設定水解時間為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 min，結果顯示（圖1），在4～6 min時，酯鍵斷裂效果最佳。

圖1 酯鍵斷裂時間對3-MCPD酯響應的影響Fig.1 Effect of transesterri fication time on response of 3-MCPD esters

2.4 方法學驗證

由于在樣品前處理過程中氯丙醇酯完全水解為氯丙醇進行后續測定，在計算氯丙醇酯的含量時分別以其對應的氯丙醇計。因此，系列標準工作溶液直接用3-MCPD和2-MCPD的混合標準溶液配制，用HFBI衍生后以GC-MS測定，記錄化合物的色譜峰面積（A）（圖2）和內標的色譜峰面積（Ai），以A和Ai的比值對相應的標準溶液中3-MCPD和2-MCPD的質量濃度進行線性回歸計算，得出線性方程，線性范圍和相關系數（r）。在5～500 μg/L范圍內，3-MCPD和2-MCPD均呈良好線性相關，r大于0.999 5。

在空白樣品中添加1、2、5、10 μg/kg四個水平的標準溶液，經樣品前處理后上機測定的響應為基礎，以信噪比為3的含量作為方法的檢出限，以信噪比為10的含量作為方法的定量限。得到3-MPCD酯和2-MPCD酯檢出限均為2.0 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg。

本實驗選取3-MCPD棕櫚酸酯作為代表物，進行3-MCPD酯的加標回收實驗。由于暫未獲得商品化的2-MCPD脂肪酸酯標準品，因此采用2-MCPD代替2-MCPD脂肪酸酯進行加標回收實驗[17]。取空白牛乳樣品分別做10、50、100 μg/kg和200 μg/kg水平的加標回收實驗（表2），3-MCPD酯和2-MCPD酯的回收率分別為73.5%～102.6%和89.1%～106.6%，相對標準偏差分別為2.3%～6.0%和3.1%～7.7%。加標回收實驗結果說明，方法的精密度和準確度良好。

圖2 3-MCPD和2-MCPD衍生物及其內標衍生物提取離子流圖（50 μg/L）Fig.2 Extracted ion chromatograms (EIC) of derivatives of 3-MCPD,2-MCPD and internal standard (50 μg/L)

表2 牛乳樣品氯丙醇酯的加標回收和精密度實驗結果（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of fatty acid esters of chloropropanediols in spiked milk (n=6)

通過前處理條件的優化，建立的方法準確可靠、靈敏度高，可同時測定兩種在食品中污染最為廣泛的單氯丙醇酯的總量，適用于液態乳中氯丙二醇脂肪酸酯總量的檢測。與大部分報道的食品中氯丙醇酯的檢測[3,22]相比，本方法的檢測靈敏度更高，達到了2 μg/kg，這對于更準確地評估氯丙醇酯對人體的膳食暴露風險提供了強有力的技術支持。

2.5 牛乳中氯丙醇酯污染水平及其對人體的健康風險評估

在北京不同區域的超市和市場采集30 份牛乳樣品，采用建立的檢測方法進行測定。30 份牛乳樣品中3-MCPD酯的檢出率為95%，含量在未檢出（not detected，ND）～13.8 μg/kg之間，平均值為4.3 μg/kg；2-MCPD酯的檢出率為83.3%，含量在ND～10.3 μg/kg之間，平均值為3.6 μg/kg。由測定結果可見，牛乳中3-MCPD酯和2-MCPD酯的污染水平相對較低。

結合2002年中國居民營養與健康狀況調查中我國標準人每日牛乳的平均消費量為21.09 g，以此估算北京地區人群3-MCPD酯的膳食暴露量，得到由于攝入牛乳而導致的3-MCPD酯的暴露量為0.001 4 μg/（kg?d），僅為3-MCPD最大耐受攝入量（provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）（2 μg/（kg?d））的0.07%。2-MCPD作為3-MCPD的同分異構體，雖目前暫無其毒性及健康指導值的文獻報道，但作為3-MCPD的同分異構體，化學結構與3-MCPD相似，因此本研究將2-MCPD酯的含量與3-MCDP酯含量加和后進行了膳食暴露評估，結果顯示，北京地區人群通過牛乳消費而攝入的3-MCPD酯與2-MCPD酯的總暴露量為0.002 6 μg/（kg?d），僅占PMTDI的0.13%。用于暴露評估的牛乳的消費量為2002年調查的數據，考慮到隨著我國人民生活水平的提高，牛乳的消費量增大，若以10 倍于2012年消費量數據估算，北京地區人群對牛乳中的氯丙醇酯的膳食暴露量也只占3-MCPD的PMTDI的1.3%，健康風險仍較低。總體而言，由牛乳消費攝入3-MCPD酯和2-MCPD酯所帶來的長期慢性暴露風險較低。由于牛乳只占人們每日膳食的很小一部分，且牛乳中氯丙醇酯含量較低，北京地區人群在每日膳食中還會攝入食用油等其他可能含有污染水平較高的氯丙醇酯的食品，因此氯丙醇酯的健康風險仍不容忽視。

3 結 論

本實驗采用堿水解和固相支持液-液萃取凈化等樣品前處理技術，建立了氣相色譜-質譜法測定牛乳中氯丙二醇脂肪酸酯含量的方法，此方法準確可靠、靈敏度高，可同時測定兩種在食品中污染最為廣泛的單氯丙醇酯的總量，適用于液態乳中氯丙二醇脂肪酸酯總量的檢測。通過對北京市售牛乳樣品進行氯丙醇酯的測定和膳食暴露評估，初步了解到牛乳中氯丙醇酯的污染水平較低，北京地區人群通過牛乳所攝入氯丙醇酯的健康風險較低。

[1]ZELINKOVA Z, DOLEZAL M, VELISEK J, et al.3-Chloropropane-1,2-diol fatty acid esters in potato products[J].Czech Journal of Food Sciences, 2009, 27: S421-S424.

[2]KUHLMANN J.Determination of bound 2,3-epoxy-1-propanol(glycidol) and bound monochloro-propanediol (MCPD) in refined oils[J].European Journal of Lipid Science and Technology, 2011,113(13): 335-344.

[3]SEEFELDER W, VARGA N, STUDER A, et al.al.Esters of 3-chloro-1,2-propanediol (3-MCPD) in vegetable oils: significance in the formation of 3-MCPD[J].Food Additives and Contaminants, 2008,25(4): 391-400.

[4]里南, 嚴小波, 方勤美, 等.我國市售食用植物油中氯丙醇酯的污染調查[J].中國糧油學報, 2013, 28(8): 28-35.

[5]Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA).Safety evaluation of certain food additives and contaminants prepared by the fifty-seventh meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA)[R].Geneva: WHO Food Additives, 2002.

[6]HAMLET C G, SADD P A, GRAY D A.Generation of monochloropropanediols (MCPDs) in model dough systems.1.leavened doughs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004,52(7): 2059-2066.

[7]HWANG M, YOON E, kIM J, et al.Toxicity value for 3-monochloropropane-1,2-diol using a benchmark dose methodology[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2009,53(2): 102-106.

[8]Federal German Institute for Risk Assessment, Stellungnahme Nr.047/2007 des BfR vom 11, BfR, Berlin[R/OL].http://www.bfr.bund.de/cm/208/saeuglingsanfangs_und_folgenahrung_kann_gesundheitlich_bednkliche_3_mcpd_fettsaeureester_enthalten.pdf.

[9]Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA).Safety evaluation of certain food additives and contaminants/prepared by the sixty-seventh meeting of Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA)[R].Geneva: WHO Food Additives, 2007.

[10]kUSTERS M, BIMBER U, OSSENBRUGGEN A, et al.Rapid and simple micromethod for the simultaneous determination of 3-MCPD and 3-MCPD esters in different foodstuffs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(11): 6570-6577.

[11]HAINES T D, ADLAF K J, PIERCEALL R M, et al.Direct determination of MCPD fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters in vegetable oils by LC-TOFMS[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2011, 88(1):1-4.

[12]YAMAZAKI K, OGISO M, ISAGAWA S, et al.A new, direct analytical method using LC-MSMS for fatty acid esters of 3-chloro-1,2-propanediol (3-MCPD esters) in edible oils[J].Food Additives and Contaminants, 2013, 30(1): 52-68.

[13]MARkUS k, UTE B.Rapid and simple micromethod for the simultaneous determination of 3-MCPD and 3-MCPD esters in different foodstuffs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010, 58(11): 6570-6577.

[14]DGF Standard Method C-Ⅲ 18 (09) Tensiden und verwandten stoffen wissenschaftliche verlagsgesellschaft[S].

[15]NAOkI k, HIROFUMI S, HIROSHI Y.Bidirectional conversion between 3-monochloro-1,2-propanediol and glycidol in course of the procedure of DGF standard methods[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2011, 88(8): 1143-1151.

[16]傅武勝, 嚴小波, 呂華東, 等.氣相色譜/質譜法測定植物油中脂肪酸氯丙醇酯[J].分析化學, 2012, 40(9): 1329-1335.

[17]LIU Q, HAN F, XIE k, et al.Simultaneous determination of total fatty acid esters of chloropropanols in edible oils by gas chromatographymass spectrometry with solid-supported liquid-liquid extraction[J].Journal of Chromatography, 2013, 1314(1): 208-215.

[18]VEJkOVSkA B, NOVOTNY O, DIVINOVA V, et al.Esters of 3-chloropropane-1,2-diol in foodstuffs[J].Czech Journal of Food Sciences, 2004, 22(5): 190-196.

[19]MASUkAWA Y, SHIRO H, NAkAMURA S, et al.A new analytical method for the quantification of glycidol fatty acid esters in edible oils[J].Journal of Oleo Science, 2010, 59(2): 81-88.

[20]HORI k, kORIYAMA N, OMORI H, et al.Simultaneous determination of 3-MCPD fatty acid esters and glycidol fatty acid esters in edible oils using liquid chromatography time-of- fl ight mass spectrometry[J].LWTFood Science and Technology, 2012, 48(2): 204-208.

[21]MORAVCOVA E, VACLAVIk L, LACINA O, et al.Novel approaches to analysis of 3-chloropropane-1,2-diol esters in vegetable oils[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402(9): 2871-2883.

[22]ZWLINkOVA Z, NOVOTNY O, SCHUREk J, et al.Occurrence of 3-MCPD fatty acid esters in human breast milk[J].Food Additives and Contaminants, 2008, 25(6): 669-676.