高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)植物蛋白食品中的特征蛋白質(zhì)

李克宏，白彥坤，周 巍，張 巖,，龐 軍，高文惠

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

植物蛋白不僅可以滿足人類對(duì)蛋白的需要，而且研究證明，植物蛋白在預(yù)防心腦血管疾病方面具有積極作用[1]，可以滿足現(xiàn)代人群對(duì)低脂、低糖、低熱能的健康食品需求[2]。植物蛋白廣泛應(yīng)用于食品加工中，相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)迫切需要建立蛋白質(zhì)定性、定量的檢測(cè)方法保證食品質(zhì)量和安全[3-7]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效毛細(xì)管電泳法，對(duì)不同產(chǎn)地的核桃、杏仁、大豆、花生樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[8-14]，并利用指紋圖譜軟件[15-19]對(duì)4 種樣品中所含蛋白種類進(jìn)行比對(duì)，找出每種樣品中的特征峰，以及樣品之間的共有峰，為快速有效地對(duì)目前市場(chǎng)存在的蛋白類飲料或其他食品中所添加蛋白類物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，杜絕如用花生等廉價(jià)蛋白食品摻加入核桃，以次充好現(xiàn)象的發(fā)生，以保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，以期為政府和監(jiān)督部門的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四硼酸鈉（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析純） 天津市海信化工有限公司；一步法活性蛋白質(zhì)提取試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CAPEL-105高效毛細(xì)管電泳儀（配有紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器） 俄羅斯劉梅克斯公司；Sigma3-18K離心機(jī) 美國(guó)Sigma Laborzentrifugen GmbH公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；0.45 μm微孔濾膜 天津博納艾杰爾科技有限公司；XK96-A快速混勻器 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 緩沖溶液配制

稱取3.813 7 g四硼酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS，用超純水定容至100 mL容量瓶中。調(diào)pH值到9.0，備用。以上溶液經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.3.2 色譜測(cè)定條件

色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱（50 cm×75 μm），分析電壓：12 kV；壓力進(jìn)樣：1 kPa，時(shí)間5 s；柱溫：40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm[20]；毛細(xì)管2 次進(jìn)樣之間用水沖洗5 min，緩沖液沖洗5 min。

1.3.3 樣品及處理

分別選取不同產(chǎn)地的核桃、杏仁、大豆、花生作為實(shí)驗(yàn)樣品。取10 mg試樣剪成細(xì)小的碎片，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，加入1 mL一步法活性蛋白質(zhì)提取劑混合液，用塑料研磨棒或勻漿器，進(jìn)行研磨或勻漿。直到?jīng)]有明顯的植物組織團(tuán)塊，渦旋振蕩1～2 min，再8 000 r/min離心5 min，取下層水相過(guò)0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物蛋白樣品測(cè)定

2.1.1 核桃樣品高效毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對(duì)8 種不同產(chǎn)地的核桃樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)不同產(chǎn)地核桃樣品的毛細(xì)管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立核桃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖1所示。

圖1 8 種不同產(chǎn)地核桃樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖對(duì)照Fig.1 Compariative chromatograms of different walnut samples from eight different geographic origins

表1 8 種不同產(chǎn)地核桃樣品共有特征峰保留時(shí)間表Table 1 Retention times of the common characteristic peaks of walnut samples from eigth areas min

由圖1和表1可以看出，核桃樣品中含有4 種共有特征峰，這4 種共有蛋白色譜峰可作為特征峰進(jìn)行摻假鑒別。

2.1.2 杏仁樣品高效毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對(duì)3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)不同產(chǎn)地杏仁樣品的高效毛細(xì)管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立杏仁標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖2所示。

圖2 3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖對(duì)照Fig.2 Comparative chromatograms of apricot kernels from three different growing areas

表2 3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品共有特征峰保留時(shí)間表Table 2 Retention times of the common characteristic peaks of apricot kernels from three growing areas min

由圖2和表2可以看出，杏仁樣品中含有4 種共有的特征峰，該4 種共有蛋白占據(jù)杏仁蛋白的90%以上，這4 個(gè)蛋白色譜峰可以作為杏仁蛋白摻假鑒別的特征峰。

2.1.3 大豆樣品高效毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對(duì)2 種不同產(chǎn)地大豆樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)不同產(chǎn)地大豆樣品的高效毛細(xì)管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立大豆標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖3所示。

圖3 2 種大豆樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋對(duì)照譜圖Fig.3 Comparative chromatograms of soybean samples from two different growing areas

通過(guò)對(duì)比圖3和表3可以確定，大豆樣品中的6 種共有蛋白可以作為大豆蛋白摻假鑒別的特征峰。

表3 2 種不同產(chǎn)地大豆樣品特征峰保留時(shí)間表Table 3 Retention times of the common characteristic peaks of soybean samples from two different growing areasmin

2.1.4 花生樣品高效毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對(duì)2 種不同產(chǎn)地花生樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)不同產(chǎn)地花生樣品的高效毛細(xì)管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立花生標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖4所示。

圖4 2 種不同產(chǎn)地花生樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋對(duì)照譜圖Fig.4 Comparative chromatograms of peanut samples from two different growing areas

表4 2 種不同產(chǎn)地花生樣品特征峰保留時(shí)間表Table 4 Retention times of the common characteristic peaks of peanut samples from two different growing areasmin

由圖4和對(duì)照表4可以看出，花生樣品譜圖中含有3 種共有的特征蛋白峰，該3種蛋白色譜峰可以作為花生蛋白摻假鑒別的特征峰。

2.1.5 不同植物蛋白樣品共有特征峰色譜圖

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地核桃、杏仁、大豆、花生樣品的測(cè)定，確定該類樣品的特征譜圖，見(jiàn)圖5。

圖5 4種樣品特征譜圖Fig.5 Characteristic chromatograms of walnut, apricot kernel,soybean and peanut

從圖5可以看出，核桃具有4 種特征峰，杏仁具有4 種特征峰，大豆具有6 種特征峰，花生具有3 種特征峰，如果在樣品檢測(cè)電泳譜圖中出現(xiàn)了新的色譜峰，或者特征蛋白含量明顯減少，則可以確定該樣品為摻假樣品。

2.2 植物蛋白摻假樣品測(cè)定

本研究的重點(diǎn)旨在采用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)植物蛋白食品中的特征蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，其次提供鑒別植物蛋白摻假的一種思路和方法。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)于植物蛋白摻假樣品進(jìn)行判定時(shí)，對(duì)實(shí)際樣品與摻假樣品質(zhì)量進(jìn)行1∶1配制，即各取5 mg干燥的植物組織配制摻假樣品。

2.2.1 3號(hào)核桃摻1號(hào)花生對(duì)照譜圖

圖6 3號(hào)核桃1號(hào)花生指紋對(duì)照譜圖Fig.6 Chromatogram of mixture of walnut sample No.3 and peanut sample No.1

對(duì)摻假樣品進(jìn)行測(cè)定，選擇3號(hào)核桃與1號(hào)花生樣品為摻假對(duì)象。由圖6可以看出，在核桃摻花生的圖譜中即出現(xiàn)了二者共有的特征峰，但也出現(xiàn)了1號(hào)花生與3號(hào)核桃譜圖中各自特有的蛋白峰。為此，將摻假圖與單純花生樣品和核桃樣品圖進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)色譜圖中相應(yīng)的特征峰可以進(jìn)行摻假鑒別。

2.2.2 1號(hào)杏仁摻1號(hào)花生對(duì)照譜圖

圖7 1號(hào)杏仁1號(hào)花生指紋對(duì)照譜圖Fig.7 Chromatogram of mixture of almond sample No.1 and peanut sample No.1

對(duì)摻假樣品進(jìn)行測(cè)定，選擇1號(hào)杏仁與1號(hào)花生樣品為摻假對(duì)象。由圖7可以看出，1號(hào)杏仁＋1號(hào)花生譜圖中，除去出現(xiàn)的杏仁和花生共有的植物蛋白峰之外，也出現(xiàn)了各自特有的蛋白峰。由于在分析過(guò)程中毛細(xì)管內(nèi)壁的Si—OH基團(tuán)幾乎全部解離，壁表面帶負(fù)電荷較多，難以保證在每次分析時(shí)壁表面狀態(tài)完全一致，進(jìn)而造成分析時(shí)電滲流大小有差異，引起遷移時(shí)間存在一定誤差。但由圖7指紋譜圖中出現(xiàn)的各自特有的蛋白峰可以進(jìn)行初步摻假鑒別。

2.2.3 1號(hào)杏仁摻2號(hào)大豆對(duì)照譜圖

對(duì)摻假樣品進(jìn)行測(cè)定，選擇1號(hào)杏仁與2號(hào)大豆樣品為摻假對(duì)象，由標(biāo)準(zhǔn)指紋對(duì)照譜圖8可以看出，出現(xiàn)了二者共有的植物蛋白峰，同時(shí)也出現(xiàn)二者所特有的蛋白峰，選用這些相應(yīng)的特征峰可以對(duì)摻假樣品進(jìn)行鑒別。

圖8 1號(hào)杏仁2號(hào)大豆指紋對(duì)照譜圖Fig.8 Chromatogram of mixture of almond sample No.1 and soybean sample No.2

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、快速的常用植物蛋白摻假鑒別的方法-毛細(xì)管電泳色譜法，樣品前處理采用了一步法活性蛋白質(zhì)提取試劑盒，該試劑盒專門用于提取植物蛋白，專一性強(qiáng)、提取液中雜質(zhì)少，可以確認(rèn)提取液中植物蛋白成分占主要部分。采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，找出同類樣品中共有特征峰，以及對(duì)不同植物蛋白互相摻假譜圖進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)特征峰及保留時(shí)間對(duì)摻假物質(zhì)進(jìn)行鑒別。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)旨在為檢測(cè)植物蛋白食品中的特征蛋白質(zhì)和植物蛋白摻假鑒別提供一種方法，也為今后的植物蛋白摻假鑒別工作提供參考。

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