太白貝母與暗紫貝母中4 種生物堿的含量比較

周 濃，郭冬琴，沈 力，陳瓊媛，覃 怡

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 404000；2.重慶三峽醫藥高等專科學校藥學系，重慶 404120）

川貝母為百合科植物太白貝母（Fritillaria taipaiensisP.Y.Li）、暗紫貝母（Fritillaria unibracteataHsiao et K.C.Hsia）等貝母屬植物的干燥鱗莖，是川產道地貴細藥材之一[1-2]。川貝母為清咽類保健食品配方中常用的中藥材之一，在民間常用于制作具有一定保健功能的藥膳食用，如川貝雪梨豬肺湯、川貝母粥、川貝杏仁鴨等[3-4]。因此，川貝母在疾病康復或日常食補中扮演著日益重要的角色，與百姓健康密切相關。

因其獨特的清熱潤肺、化痰止咳、散結消癰的功效而馳名中外，其主要活性成分為甾體生物堿、皂苷、萜類、糖苷等[5]。行業內普遍認為生物堿為川貝母主要的有效成分和專屬性成分，但由于來源復雜，且不同基源種、商品規格之間生物堿的含量差異很大[6-9]。因此，本研究在現有川貝母中生物堿含量測定[7-12]的研究基礎上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對不同商品名稱太白貝母栽培品與松貝、青貝藥材中貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙進行質量對比分析評價，以期為太白貝母藥材全面的質量控制和規范化種植與采收提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太白貝母樣品，2011年7月采自重慶市巫溪縣蘭英鄉太白貝母種植基地，經鑒定為百合科植物太白貝母（Fritillaria taipaiensis）的干燥鱗莖，根據不同生長年限而藥材形狀和大小不同分為6 個樣品，分別稱作松尖、小尖、中尖、大尖、花生小貝和花生大貝；松貝、青貝樣品，2011年6月采自四川省松潘縣，經鑒定為百合科植物暗紫貝母（Fritillaria unibracteata）的干燥鱗莖。

西貝母堿苷、貝母素甲和貝母素乙對照品（批號分別為：111917-201001、10750-200608、10751-200606） 中國食品藥品檢定研究院；貝母辛對照品（檢測HPLC≥98%） 成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；石油醚、三氯甲烷、甲醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司重慶分公司。

1.2 儀器與設備

1100型高效液相色譜系統 美國安捷倫公司；RE-2000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；DKS-28型恒溫水浴鍋 嘉興中新醫療儀器有限公司；AL240-IC型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.02%三乙胺溶液（pH 7.5）∶（V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（0.02%三乙胺溶液））＝3.5∶67.5∶29.0；檢測波長205 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；峰面積積分值為手動積分。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙對照品4.090、4.020、2.075、1.020 mg，加甲醇溶解并配成質量濃度分別為0.818、0.804、0.415、0.204 mg/mL的對照品貯備液，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過五號篩，（180±7.6）μm）5.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加150 mL石油醚（30～60 ℃）浸泡12 h進行脫脂處理，過濾，濾渣水浴揮干后加質量分數28%濃氨試液10 mL，浸潤2 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（V（三氯甲烷）∶V（甲醇）＝4∶1）的混合溶液150 mL，混勻，置70 ℃水浴中加熱回流3 h，放冷，濾過，回收濾液至干，殘渣加甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.3.4 線性關系考察

分別精密吸取不同體積的各對照品貯備溶液，采用逐級稀釋法分別制取貝母辛51.125、102.25、204.5、409.0、613.50、818.0 μg/mL，西貝母堿80.4、160.8、321.6、482.4、643.2、804.0 μg/mL，貝母素甲41.5、83.0、166.0、249.0、332.0、415.0 μg/mL和貝母素乙10.2、20.4、51.0、102.0、153.0、204.0 μg/mL的對照品標準液。分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，依次進樣分析，記錄色譜峰面積，以各對照品的峰面積積分值（Y）與其質量濃度（X）進行線性回歸，得到其線性回歸方程、相關系數和線性范圍。

1.3.5 精密度實驗

取同一對照品溶液，連續進樣6 次，記錄其色譜峰面積，通過計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）以考察儀器的精密度。

1.3.6 重復性實驗

取同一太白貝母樣品6 份（花生大貝），制備供試品溶液，記錄其色譜峰面積，通過計算RSD以考察本方法的重復性。

1.3.7 穩定性實驗

將配制好的供試品溶液（花生大貝）在室溫條件下密閉放置，分別于0、4、8、12、16、20 h測定，記錄其色譜峰面積，通過計算RSD以考察本樣品的穩定性。

1.3.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的川貝母藥材約2.50 g（花生大貝），共6 份，分別精密加入貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲和貝母素乙對照品貯備溶液0.50、0.20、0.20、0.10 mL，制備樣品供試品溶液并進行測定，驗證該方法的準確性，計算加樣回收率。

1.3.9 樣品含量測定

制備8 批樣品溶液，測定其4 種生物堿的含量。

2 結果與分析

2.1 樣品的液相色譜測定結果

4 種生物堿對照品及太白貝母、暗紫貝母樣品分離的色譜圖。由圖1可知，在該色譜條件下，貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙能在22 min以內很好的分開，并與其他化學成分無干擾，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5。同時，太白貝母和暗紫貝母的HPLC色譜圖具有一定的相似性，說明不同品種川貝母在此色譜條件下存在各活性成分量比關系的不同，但還存在自身的特征峰。

圖1 對照品（A）、太白貝母（B）、暗紫貝母（C）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and samples

2.2 線性關系考察的結果

得線性回歸方程分別為：貝母辛：Y=34.273X＋82.194，r=0.999 7；西貝母堿苷：Y=0.971 2X－2.195 9，r=0.999 5；貝母素甲：Y=1.758 6X－4.116 2，r=0.999 5；貝母素乙：Y=2.857 8X－0.489 0，r=0.999 1。貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙分別在51.125～818.0、80.4～804.0、41.5～415.0、10.2～204.0 μg/mL線性范圍內其質量濃度與積分峰面積具有良好的線性關系，相關系數達到0.999 1以上。

2.3 精密度實驗

貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙色譜峰面積的RSD分別為0.81%、2.09%、1.26%、1.68%，充分說明儀器的精密度良好。

2.4 重復性實驗

貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙的含量分別為0.153 6、0.060 2、0.039 7、0.007 9 mg/g，RSD分別為0.38%、2.26%、1.88%、1.92%，表明該方法的重復性良好。

2.5 穩定性實驗

貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙色譜峰面積的RSD分別為1.22%、3.54%、2.65%、2.80%，說明樣品溶液至少在20 h內穩定。

2.6 加樣回收率實驗

太白貝母（花生大貝）中4種生物堿的平均回收率在90.76%～98.23%，RSD1.29%～2.96%，符合分析要求，結果見表1。表明上述實驗方法的準確度較高，能應用于川貝母中生物堿活性成分的檢測與分析。

表1 加樣回收率實驗結果Table 1 Results of recovery rate tests

2.7 樣品含量測定

按外標兩點法定量，分別計算貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙的含量，結果見表2。

表2 太白貝母與暗紫貝母中4 種生物堿類化合物的含量Table 2 Contents of 4 alkaloids in F.taipaiensis and F.unibracteata mg/g

由表2可知，太白貝母和暗紫貝母中生物堿類成分比較相似，均含有貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲。貝母辛在太白貝母中含量較高，西貝母堿苷次之，貝母素甲、貝母素乙含量最低；而暗紫貝母中西貝母堿苷、貝母素甲含量較高，貝母辛次之，貝母素乙未檢出。但不同品種川貝母所含生物堿的種類及含量多少差異較大，太白貝母中含有較多的貝母辛與西貝母堿苷、暗紫貝母中含有較多的西貝母堿苷與貝母素甲，太白貝母活性成分含量略高于暗紫貝母，這與曹新偉[13]對太白貝母和暗紫貝母中生物堿含量比較的結果相一致，與沈力等[14]對其兩者藥效學研究結果基本一致，進一步說明太白貝母是川貝母中適宜人工栽培的最佳品種之一[15]。因此，從生物堿活性成分的角度來看，太白貝母與暗紫貝母所含的生物堿類化學成分有一定的相似性，又有各自不同的特征性活性成分，傳統用藥將太白貝母同作為川貝母使用，而且2010年版《中國藥典》已將太白貝母列為川貝母項下，有一定的科學依據。

由表2還可知，太白貝母中貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲和貝母素乙含量水平整體上呈現出隨著生長年限（花生大貝、花生小貝＞大尖、中尖、小尖＞松尖）增加而減小的趨勢，與王懷玉[9]、段寶忠[11]等研究結果基本一致，說明太白貝母的最適生長與其次生代謝物質合成對生態環境條件的要求有一定的矛盾，導致生物堿含量和產量不能同步增長，進一步表明人工栽培技術在提高其品質方面尚未成熟。同時，松貝中貝母辛、西貝母堿苷和貝母素甲的含量明顯較青貝高，與傳統上認為松貝的質量好于青貝的觀點一致，該現象是否具有普遍性，還有待于更多樣本的收集與驗證。

3 結 論

本實驗采用HPLC法建立了同時檢測太白貝母和暗紫貝母中主要活性成分貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙的含量測定方法，本方法前處理簡單快速、專屬性強、靈敏度高、定量準確，可用于精確測定川貝母中生物堿類成分的含量，適宜于川貝母藥材及其制劑的質量控制，具有一定實用價值。

通過對同一產地不同商品名稱太白貝母與暗紫貝母中生物堿提取物在本實驗條件下的定性和定量綜合分析評價表明，8 批樣品整體化學成分組成相似、藥效亦相近，其中人工栽培太白貝母中單體生物堿貝母辛、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙含量略高于暗紫貝母，但按照現行版《中國藥典》的質量標準要求，2 種基源的川貝母作為同一藥材使用是可行的。

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