基于銅納米團(tuán)簇的納米探針比色法檢測(cè)牛奶中膽固醇含量

劉 迪，尚 華

（陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織學(xué)院，陜西 咸陽 721000）

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇是動(dòng)物體內(nèi)最重要的固醇，通常是以游離狀態(tài)或酯化狀態(tài)的形式存在于動(dòng)物組織中，是動(dòng)物體維持正常生理活動(dòng)所必需的[1-6]。從20世紀(jì)80年代初期開始，作為一種可能危害人體健康的食品組分——膽固醇，已逐漸成為國內(nèi)外食品醫(yī)學(xué)界辯論的熱門話題。近年來，我國人民的膽固醇攝取量，由于動(dòng)物性食物之?dāng)z食增加而逐年遞增。但是，人體內(nèi)過多的膽固醇將引起高血脂，并進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等一系列心血管疾病，因此控制飲食膽固醇攝入是非常必要的。食品中膽固醇的檢測(cè)越來越引起重視，這就要求建立一種簡便、快速且重現(xiàn)性好的測(cè)定膽固醇方法。

目前，膽固醇的定量分析方法主要有比色法、酶法、分子發(fā)光法、溫度測(cè)定法、電化學(xué)方法、氣相色譜法和高效液相色譜法[7-12]。然而這些傳統(tǒng)的膽固醇檢測(cè)技術(shù)存在實(shí)際應(yīng)用上的缺陷。例如，傳統(tǒng)的比色法由于操作手續(xù)繁雜，所需試劑多，造成了比色結(jié)果的偏差和計(jì)算結(jié)果的復(fù)雜化，且成本高，從而限定了該方法的廣泛使用。另一方面，酶法由于技術(shù)含量較高，特異性強(qiáng)，而其他方法又需要特殊的設(shè)備，所以都難于推廣使用。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、方便的測(cè)定方法是必要的。本研究利用銅納米團(tuán)簇的過氧化酶活性，結(jié)合膽固醇被膽固醇氧化酶催化氧化產(chǎn)生的雙氧水，以愈創(chuàng)木酚作為顯色底物，建立一種基于銅納米團(tuán)簇[13-16]的納米探針[17-19]比色檢測(cè)牛奶中膽固醇的方法，旨在建立一種測(cè)定牛奶中膽固醇的較簡單、易普及的納米技術(shù)分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市售；牛血清蛋白、膽固醇、膽固醇氧化酶 美國Sigma公司；五水硫酸銅、愈創(chuàng)木酚、卵磷脂、腦磷脂、乳蛋白、葡萄糖、葉酸 阿拉丁試劑（上海）有限公司；VA、VD、VE、VC 廣州西隴化學(xué)試劑公司；無水乙醇、乙醚、石油醚均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為18.25 MΩ超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-4600型熒光分光光度計(jì)、HT7700型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；CS110-4型真空冷凍干燥機(jī)丹麥Labogene公司；實(shí)驗(yàn)室純水機(jī) 越純科技（廣東）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銅納米團(tuán)簇合成

銅納米簇合成采用已有文獻(xiàn)[20]報(bào)道的方法，將1 mL CuSO4·5H2O水溶液（20 mmol/L）加入到5 mL牛血清蛋白（albumin from bovine serum，BSA）溶液（15 mg/mL）。該溶液在室溫條件下攪拌2～3 min，然后添加NaOH溶液，使得反應(yīng)環(huán)境的pH值為12。此時(shí)，在2～5 min時(shí)間范圍內(nèi)，溶液的顏色由藍(lán)色變?yōu)樽仙Ｈ缓螅?5 ℃恒溫條件下，將所得混合物繼續(xù)劇烈攪拌6～8 h，觀察此時(shí)顏色變?yōu)榈厣礊榻K止反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。最后，將淡棕色溶液用3 000 u的透析袋透析48 h，以達(dá)到出去溶液中多余的Cu2+，得到實(shí)驗(yàn)所用的銅納米團(tuán)簇。

1.3.2 銅納米團(tuán)簇表征

利用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜及透射電子顯微鏡（transmission eectron microscope，TEM）進(jìn)行銅納米團(tuán)簇（copper nanoclusters，CuNCs）的表征實(shí)驗(yàn)，以此驗(yàn)證CuNCs的合成是否成功。

1.3.3 牛奶樣品處理[8]

1.3.3.1 皂化

準(zhǔn)確稱取樣品5 g，精確至0.000 1 g，于250 mL平底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇和10 mL質(zhì)量濃度60 g/100 mL的kOH溶液。將試樣置恒溫磁力攪拌器（150 ℃、400 r/min）上皂化回流1 h，不時(shí)振蕩防止試樣黏附在瓶壁上，皂化結(jié)束后，用5 mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取下燒瓶，冷卻至室溫。

1.3.3.2 提取

定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于250 mL分液漏斗中，用30 mL水，分2～3 次沖洗平底燒瓶，合并入分液漏斗中，再用40 mL石油醚（60～90 ℃）和乙醚混合液（1∶1，V/V）分2～3 次沖洗平底燒瓶，合并入分液漏斗中，加蓋，放氣，混合，振搖2 min，靜置，分層。轉(zhuǎn)移水相于第2個(gè)分液漏斗中，再用30 mL石油醚和乙醚混合液（1∶1，V/V）重復(fù)提取2 次，棄去水相，合并3 次有機(jī)相，用蒸餾水洗滌提取液至中性，初次水洗時(shí)輕輕旋搖防止乳化，提取液轉(zhuǎn)移至150 mL平底燒瓶中。

1.3.3.3 濃縮

將上述平底燒瓶中的提取液在真空45 ℃條件下水浴蒸發(fā)至干殘?jiān)脽o水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，溶液通過0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 高效液相色譜法檢測(cè)牛奶膽固醇

色譜柱：Wondasil型C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長203 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 檢測(cè)pH值優(yōu)化

將CuNCs放在0.01 mol/L HAc-NaAc緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)溶液中，分別調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，測(cè)定CuNCs催化效果，不同的催化效果用吸光度表示，根據(jù)結(jié)果優(yōu)選出最佳的測(cè)定pH值。

1.3.6 膽固醇的檢測(cè)

在37 ℃條件下，將50 μL膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，ChOx，2 U/mL）和25 μL不同質(zhì)量濃度的膽固醇添加到由1.3.5節(jié)確定最優(yōu)pH值的0.01 mol/L HAc-NaAc緩沖液中，孵育30 min。然后，添加40 μL愈創(chuàng)木酚（0.3 mmol/L）、50 μL CuNCs至上述緩沖液中，30 ℃孵育15 min。觀察溶液顏色變化，且測(cè)量該溶液吸光度。

1.3.7 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢出限測(cè)定實(shí)驗(yàn)

分別配制質(zhì)量濃度為0、10、40、80、100、160、200 μg/mL和320 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇系列溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，按照1.3.6節(jié)方法測(cè)定各溶液在波長為0～800 nm之間的吸光度。分析吸光度與膽固醇質(zhì)量濃度之間的變化關(guān)系，尋找最佳線性吸收波長和線性檢測(cè)膽固醇質(zhì)量濃度范圍，測(cè)定線性曲線和線性相關(guān)系數(shù)。同時(shí)根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）建議，確定該方法的檢出限。

1.3.8 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取按照1.3.3節(jié)制備好的牛奶樣品5 mL，按照1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)方法分別測(cè)定膽固醇含量，重復(fù)6 次，比較高效液相色譜法和CuNCs比色法膽固醇測(cè)定結(jié)果，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），評(píng)價(jià)該方法的精密度。

1.3.9 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

從同一批次牛奶產(chǎn)品中各取6 份樣品5 g，按1.3.3節(jié)方法制備牛奶樣品，按照1.3.6節(jié)方法對(duì)每份牛奶樣品平行測(cè)定6 次分析膽固醇含量，計(jì)算RSD，評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性。

1.3.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制備好的牛奶樣品在室溫條件下放置，分別在0、1、2、4、8、16 h后按照1.3.6節(jié)方法測(cè)定膽固醇含量，計(jì)算RSD，評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

1.3.11 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

對(duì)不同的市售牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，市售牛奶按照1.3.3節(jié)方法處理牛奶樣品，然后按照1.3.4節(jié)方法測(cè)定不同牛奶中膽固醇含量。稱取不同牛奶樣品3 份，每份約5 g，精密稱量，分別精密加入1.0 mL質(zhì)量濃度為0.688 0 mg/mL和1.376 0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液，按1.3.3節(jié)方法制備加標(biāo)牛奶樣品，按照1.3.6節(jié)方法對(duì)每份加標(biāo)牛奶樣品平行測(cè)定6 次測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性。

1.3.12 干擾實(shí)驗(yàn)

選擇牛奶中含量較多的非膽固醇成分做干擾實(shí)驗(yàn)。分別取10 份市售牛奶100 mL，分別加入25 mg膽固醇、卵磷脂、腦磷脂、乳蛋白、葡萄糖、VA、VD、VE、VC和葉酸，另取1 份市售牛奶100 mL，分別按照1.3.3節(jié)和1.3.6節(jié)方法處理和測(cè)定各樣品的吸光度，再用加入各標(biāo)準(zhǔn)品牛奶樣品吸光度與原牛奶樣品吸光度之差，考察不同干擾物質(zhì)對(duì)牛奶中膽固醇測(cè)定的干擾影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅納米團(tuán)簇表征結(jié)果

圖1表示CuNCs和BSA紫外-可見吸收光譜，雖然BSA在280 nm波長處有明顯的紫外吸收峰，但CuNCs與BSA光譜圖相比，CuNCs在325 nm波長處出現(xiàn)了明顯吸收強(qiáng)度變大的現(xiàn)象。結(jié)合文獻(xiàn)[20]報(bào)道，可以得出325 nm波長處的紫外吸收峰可能為CuNCs的特征吸收峰，初步判斷該納米團(tuán)簇可能被合成。為了進(jìn)一步確定，根據(jù)CuNCs熒光特性，本實(shí)驗(yàn)用熒光光譜圖對(duì)CuNCs的合成與否進(jìn)一步驗(yàn)證。如圖2所示，CuNCs在激發(fā)波長為335 nm時(shí)，有明顯的熒光吸收強(qiáng)度；而當(dāng)它在發(fā)射波長為410 nm處，CuNCs也出現(xiàn)的一個(gè)強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，CuNCs展現(xiàn)的這種熒光吸收特征符合文獻(xiàn)[21]報(bào)道，由此，可以判斷CuNCs合成成功。因此，結(jié)合紫外-可見吸收光譜和熒光吸收光譜得出，按照水熱法合成的此種CuNCs即為具有模擬辣根過氧化物酶活性的銅納米團(tuán)簇。為了進(jìn)一步評(píng)估本實(shí)驗(yàn)中合成CuNCs粒徑大小，根據(jù)文獻(xiàn)[20]提供的合成和表征方法，本實(shí)驗(yàn)用高分辨率的透射電鏡圖進(jìn)行表征。如圖3所示，表明本實(shí)驗(yàn)合成的CuNCs小于10 nm（約3 nm），這種CuNCs的形態(tài)特征與文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道是一致的。

圖1 CuNCs和BSA紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-vis absorption spectra of CuNCs and BSA

圖2 CuNCs熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of CuNCs

圖3 CuNCs的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM image of CuNCs

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果

CuNCs的催化活性、測(cè)定的靈敏度和穩(wěn)定性與反應(yīng)溶液的pH值有關(guān)，因此，為了最大程度地保持CuNCs的反應(yīng)速度和活性，必須確定測(cè)定的最佳pH值，結(jié)果如圖4所示。緩沖液的pH值在6.5時(shí)具有最高的吸光度，顯示在此pH值時(shí)CuNCs的催化活力最高，穩(wěn)定性最好；當(dāng)pH值上升或下降時(shí)，吸光度都變小。因此，選擇pH 6.5的0.01 mol/L HAc-NaAc緩沖液作為反應(yīng)溶液。

圖4 不同pH值對(duì)檢測(cè)體系影響Fig.4 Effect of different pH values on the absorbance of the reaction mixture

2.3 檢測(cè)范圍和檢出限測(cè)定結(jié)果

為了對(duì)基于CuNCs納米比色檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行評(píng)估，選擇不同質(zhì)量濃度的膽固醇作為目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示，結(jié)果表明，隨著膽固醇質(zhì)量濃度增加，相對(duì)應(yīng)的混合溶液吸光度也增加。這是因?yàn)榉磻?yīng)體系中膽固醇越多，它被膽固醇氧化酶氧化產(chǎn)生的H2O2越多，則參與到CuNCs比色感應(yīng)中的H2O2數(shù)量越多，導(dǎo)致反應(yīng)越強(qiáng)，這樣吸光度越大。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度和膽固醇質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)較好線性關(guān)系（R2=0.997 1）。通過分析得出，在波長為420 nm處吸光度與膽固醇質(zhì)量濃度在40～320 μg/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如圖6所示。根據(jù)IUPAC建議，測(cè)得方法的檢出限為5 μg/mL膽固醇。

圖5 CuNCs催化不同質(zhì)量濃度膽固醇紫外-可見吸收光譜圖Fig.5 UV-Vis absorption spectra of different concentrations of cholesterol under CuNCs catalysis

圖6 膽固醇質(zhì)量濃度與吸光度的線性相關(guān)性Fig.6 Linear relationship between cholesterol concentrations and absorbance

2.4 精密度

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests

如表1所示，CuNCs比色法檢測(cè)膽固醇含量檢測(cè)結(jié)果的RSD值為0.16%，高效液相色譜法檢測(cè)膽固醇含量檢測(cè)結(jié)果的RSD值為0.14%，表明此方法與高效液相色譜法具有比較接近的精密度，并且該方法的精密度滿足分析檢驗(yàn)精密度要求。

2.5 重現(xiàn)性

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of reproducibility tests

如表2所示，膽固醇含量的RSD值為0.36%，滿足分析檢驗(yàn)重現(xiàn)性要求，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.6 穩(wěn)定性

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability tests

如表3所示，膽固醇含量的RSD值為0.25%，表明該牛奶樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 準(zhǔn)確性

表4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of accuracy tests

如表4所示，所得的3 份樣品的回收率在99.5%～101.2%之間，RSD在1.7%～2.9%之間，表明本方法準(zhǔn)確性較好。

2.8 干擾實(shí)驗(yàn)

圖7 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of interference tests

如圖7所示，牛奶中共存的卵磷脂、腦磷脂、乳蛋白、葡萄糖、VA、VD、VE、VC和葉酸成分，對(duì)牛奶中膽固醇的測(cè)定基本無干擾，由此可以看出，本方法具有較好的抗干擾性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種利用納米技術(shù)測(cè)定牛奶中膽固醇的方法，該方法操作簡便可靠、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、抗干擾性均較好，可以較快速準(zhǔn)確的對(duì)牛奶中膽固醇成分進(jìn)行定量分析，是分析牛奶中膽固醇成分較理想的方法。本檢測(cè)方法中，銅納米團(tuán)簇的合成和樣品的制備步驟較為復(fù)雜、耗時(shí)，是進(jìn)一步提高此方法快速檢測(cè)性的一個(gè)突破口，有待改進(jìn)。基于目前的研究，本檢測(cè)方法適用的范圍為牛奶中膽固醇的檢測(cè)，本檢測(cè)方法應(yīng)用于其他含膽固醇產(chǎn)品的檢測(cè)有待于進(jìn)一步研究。

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