頂空固相微萃取與氣相色譜-電子捕獲技術(shù)聯(lián)用檢測軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚

張哲琦，王玉春，陳 臣，李 艷,3,

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省分析測試研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

葡萄酒質(zhì)量的好壞在很大程度上取決于它特有的風味，然而，許多葡萄酒由于2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）的污染，使得其散發(fā)出一種霉味，從而大大的影響了酒的品質(zhì)[1]。據(jù)估計，每年因為TCA的污染，使葡萄酒行業(yè)損失達100億 美元甚至更多[2-3]。然而，葡萄酒中大部分TCA都是由軟木塞中的TCA遷移進酒中[4]。研究表明，軟木塞中的TCA是櫟樹生長和軟木塞加工過程中霉菌降解環(huán)境中的2,4,6-三氯苯酚轉(zhuǎn)化成的TCA[5]。因此，準確地檢測出軟木塞中TCA含量并去除，可確保葡萄酒的風味質(zhì)量。

美國食品藥品監(jiān)督管理局的研究報告表明，消費者不可接受的TCA閾值水平一般在3.1 ng/L[6]。檢測TCA，樣品前處理的方法很多，包括固相萃取[7]、超聲波輔助萃取[8]、液-液萃取[9]等，這些方法都較為繁瑣[10]。頂空固相微萃取技術(shù)（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是目前應用最廣、最易操作的方法。該方法選擇性高、耗時短、回收率高，不需要大量的有機溶劑就能夠完成TCA的檢測分析[11-16]。另有研究指出，氣相色譜-電子俘獲檢測器（gas chromatography with electron-capture detection，GC-ECD）廣泛用于檢測TCA，與其他檢測器相比精準度更高更靈敏[17]。本研究擬建立采用GC-ECD檢測葡萄酒軟木塞中TCA含量的方法，并有效地對軟木塞中的TCA含量進行檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

11 種軟木塞浸泡液 石家莊市百博貿(mào)易有限公司。TCA（純度99%） 美國Aldrich公司；內(nèi)標物2,4-二氯苯甲醚（2,3-dichloroanisole，DCA，純度99%）、氯化鈉（分析純） 天津希恩思生化科技有限公司；乙醇（色譜純，純度99.9%） 韓國德山藥業(yè)工廠；實驗用水為超純水，由明澈-D 24UV超純水機制備。

CP-3800氣相色譜儀（配電子俘獲檢測器） 美國Varian公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、20 mL頂空瓶、涂有聚四氟乙烯螺旋蓋 德國CNW公司；手動固相微萃取手柄、磁子及100 μm聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭 美國Sigma公司。

1.2 方法

參照國際標準化的方法[18]進行TCA萃取與檢測。

1.2.1 標準品制備

TCA標準品的制備：用色譜級乙醇制備10－2g/L的TCA標準液，然后再用12%乙醇溶液逐級稀釋成10－4g/L和4×10－7、8×10－7、15×10－7、25×10－7、50×10－7g/L的使用液。

DCA標準品的制備：用色譜級乙醇制備10－2g/L的DCA標準液，再用12%乙醇溶液稀釋成10－4g/L的使用液。

1.2.2 萃取方法

向20 mL頂空瓶中加入3.00 g的氯化鈉固體，準確吸取9.8 mL的12%乙醇于頂空瓶中，再向其分別加入100 μL TCA使用液和DCA使用液，加入磁子，擰緊瓶蓋。將其放置在35 ℃恒溫磁力攪拌器中。將轉(zhuǎn)速調(diào)至1 750 r/min，將萃取針插入頂空瓶中，平衡15 min，推出萃取頭，萃取25 min后拔出萃取針，立即移至氣相色譜進樣口處，解吸3 min。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱HP-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；氮氣流速1 mL/min；進樣口溫度260 ℃，檢測器溫度280 ℃，不分流進樣。升溫程序：50 ℃保持2 min，以9.0 ℃/min的速率升至150 ℃保持2 min，再以20.0 ℃/min的速率上升至260 ℃保持5 min。

1.2.4 軟木塞浸泡液的制備

在100 個軟木塞中隨機挑選5 個，將其放在250 mL的廣口瓶中，然后倒入已配制好的12%乙醇溶液，直到將所有軟木塞浸沒，24 h后將浸泡液倒出。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA的保留時間

GC-ECD對含有鹵素的化學物質(zhì)具有很高的靈敏性，對于TCA的檢測GC-ECD是很好地選擇，但是它不能像氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用一樣直接對TCA進行定性分析。因此，本方法測定0、4 ng/L和8 ng/L 3 個不同質(zhì)量濃度的TCA標準品，從而確定TCA的保留時間，結(jié)果見圖1。由圖1可見，3 個不同質(zhì)量質(zhì)量濃度TCA標準品的保留時間相同，只是峰面積隨質(zhì)量濃度而變化，因此可以確定TCA的保留時間為（10.27±0.05）min。

圖1 不同質(zhì)量濃度的TCA保留時間色譜圖Fig.1 Retention times of TCA at various concentrations

2.2 線性實驗

以12%乙醇為基質(zhì)，準確加入TCA和DCA使用液，使TCA的最終質(zhì)量濃度分別為0、4、8、15、25 ng/L和50 ng/L，同時DCA的質(zhì)量濃度保持不變，均為10－6g/L。按照HS-SPME的方法對這幾種標準溶液進行萃取。經(jīng)GCECD分析后，以TCA的峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，制作標準曲線。標準曲線的線性方程為：y=20 302x+5 976.7，R2 =0.999 9，線性范圍為0～50 ng/L。由此可以看出，該方法測定TCA含量，可以得到很好的線性關(guān)系。

檢出限和定量限分別定義為：a+3sa/b和a+10sa/b，式中：a為原點縱坐標的值，b為斜率，sa為原點縱坐標的方差[19]。因此，檢出限為0.20 pg/L，定量限為0.66 pg/L。

2.3 準確度與精密度實驗

準確度是指分析測定結(jié)果與真實值或參考值之間接近的程度，常常用回收率的結(jié)果來評價方法的準確度[20]。通常會用兩種方法測定回收率，即空白加標回收率和樣品加標回收率。本實驗采用了樣品加標回收率，即向處理好的軟木塞浸泡液中分別添加3 種不同質(zhì)量濃度的TCA標準液，分別是4、8、15 ng/L，每個質(zhì)量濃度做3 次平行。同時，采用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度，結(jié)果見表1。

表1 TCA檢測方法的回收率和精密度（n=3）Table 1 Recoveries and precision (RSD) of TCA (n=3)

由表1可以看出，所測得回收率在101%～108%之間，RSD不大于5.6%，說明該方法的準確度和精密度都比較好。

2.4 軟木塞樣品中TCA含量的檢測

采用所建立的檢測方法對11 種不同類型的葡萄酒軟木塞進行了測定，檢測結(jié)果是每種軟木塞浸泡液最少平行測定3 次所得結(jié)果，見表2。

表2 葡萄酒軟木塞中TCA含量的測定（n=3）Table 2 Results of TCA determination in different kinds of wine corks (n=3)

由表2可以看出，葡萄酒軟木塞中TCA的含量在發(fā)霉的原料中較高，制得成品的加工過程中含量下降，成品軟木塞中TCA含量（4～11號樣品）均在4 ng/L以下，普通消費者感知不到該質(zhì)量濃度的TCA。本實驗所建檢測方法可以測得軟木塞中痕量的TCA，且RSD均在10%以下，證明該方法的精密度較好。

3 結(jié) 論

隨著葡萄酒與軟木塞行業(yè)的發(fā)展，軟木塞的污染問題也越來越受到人們的關(guān)注，TCA的檢測也受到了全球各國的關(guān)注[9]?；诖爽F(xiàn)狀，本研究建立了一種利用HS-SPME和GC-ECD測定葡萄酒軟木塞中TCA含量的方法。該方法的線性關(guān)系好（R2 =0.999 9）、回收率高（101%～108%）、精密度好（RSD不大于5.6%）。由于GC-ECD的高靈敏性，因此該方法的檢出限低于TCA的閾值范圍，所得到的檢出限為0.20 pg/L，定量限為0.66 pg/L。檢測11 種軟木塞中TCA含量驗證該方法，可以檢出相當?shù)秃康腡CA，適用于軟木塞中痕量TCA的檢測，為未來我國對TCA檢測標準的制定和含量監(jiān)控提供了一種參考方法。該方法與國內(nèi)外許多研究結(jié)果較為一致[1,8,13,21]，且靈敏性更高。同時，該方法避免了使用大量的有機溶劑，節(jié)省時間，因此是一種行之有效地檢測葡萄酒軟木塞中TCA含量的方法。

[1]陳樹兵, 孟原, 施瑛, 等.頂空-固相微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中多種氯酚及氯代茴香醚[J].食品科學, 2012, 33(16):146-149.

[2]JUANOLA R, SUBIRA D, SALVADO V, et al.Evaluation of an extraction method in the determination of the 2,4,6-trichloroanisole content of tainted cork[J].Journal of Chromatography A, 2002, 953(1): 207-214.

[3]EVANS T J, BUTZkE C E, EBELER S E.Analysis of 2,4,6-trichloroanisole in wines using solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 1997, 786(2): 293-298.

[4]LIZARRAGA E, IRIGOYEN A, BELSUE V.Determination of chloroanisole compounds in red wine by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2004, 1052(1): 145-149.

[5]MAZZOLENI V, MAGGI L.Effect of wine style on the perception of 2,4,6-trichloroanisole, a compound related to cork taint in wine[J].Food Research International, 2007, 40(6): 694-699.

[6]PRESCOTT J, NORRIS L, kUNST M, et al.Estimating a “consumer rejection threshold” for cork taint in white wine[J].Food Quality and Preference, 2005, 16(4): 345-349.

[7]MARTíNEZ-URU?UELA A, RODRíGUEZ I, CELA R, et al.Development of a solid-phase extraction method for the simultaneous determination of chloroanisoles and chlorophenols in red wine using gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta, 2005, 549(1): 117-123.

[8]張素娟, 梁寶愛, 孫麗萍, 等.超聲波輔助-頂空固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒中痕量 2,4,6-三氯苯甲醚[J].食品工程, 2012(1): 45-48.

[9]房玉林, 孟江飛, 張昂, 等.葡萄酒及軟木塞中TCA的檢測分析方法研究現(xiàn)狀及應用前景[J].食品科學, 2009, 30(21): 469-475.

[10]PIZARRO C, PéREZ-DEL-NOTARIO N, GONZáLEZ-SáIZ J M.Multiple headspace solid-phase microextraction for eliminating matrix effect in the simultaneous determination of haloanisoles and volatile phenols in wines[J].Journal of Chromatography A, 2007, 1166(1): 1-8.

[11]雷安亮, 鐘其頂, 劉長江, 等.葡萄酒香氣分析方法研究現(xiàn)狀及應用展望[J].釀酒, 2008(6): 24-28.

[12]RIU M, MESTRES M, BUSTO O, et al.Quantification of chloroanisoles in cork using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography with electron capture detection[J].Journal of Chromatography A, 2006, 1107(1): 240-247.

[13]PIZARRO C, MARTINEZ-URüNUELA A, PEREZ-DEL-NOTARIO N, et al.Robustness test of a headspace solid-phase microextraction method for the determination of chloroanisoles and chlorophenols related to cork taint in wine using experimental design[J].Journal of Chromatography A, 2008, 1208(1): 54-61.

[14]禹春鶴, 胡斌, 江祖成.攪拌棒吸附萃取研究進展[J].分析化學,2006, 34(9): 289-294.

[15]趙良雨, 馮志彪.新型樣品前處理: 攪拌棒吸附萃取技術(shù)及其在食品分析中的應用[J].飲料工業(yè), 2008(11): 8-11.

[16]CULLERE L, LOPEZ R, CACHO J F.Determination of important odor-active aldehydes of wine through gas chromatography-mass spectrometry of theirO-(2,3,4,5,6-penta fl uorobenzyl) oximes formed directly in the solid phase extraction cartridge used for selective isolation[J].Journal of Chromatography A, 2004, 1028(2): 339-345.

[17]RIU M, MESTRES M, BUSTO O, et al.Determination of total chloroanisoles in different kinds of cork stoppers[J].Analytica Chimica Acta, 2006, 563(1): 310-314.

[18]Technical Committee ISO/TC 87, Cork.ISO 20752—2007 International Organization for Standardization[S].

[19]ZALACAIN A, ALONSO G L, LORENZO C, et al.Stir bar sorptive extraction for the analysis of wine cork taint[J].Journal of Chromatography A, 2004, 1033(1): 173-178.

[20]齊美玲.氣相色譜分析及應用[M].北京: 科學出版社, 2013: 66-69.

[21]RIU M, MESTRES M, BUSTO O, et al.Determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines by headspace solidphase microextraction and gas chromatography-electron-capture detection[J].Journal of Chromatography A, 2002, 977(1): 1-8.